ВАРТОЦИД (имихимод). Глава 3

Глава 3. Биологические и фармакологические свойства

Биологические свойства и фармакодинамика имихимода. Первоначально имихимод, как уже упоминалось, предполагали применять при лечении бронхолегочной патологии в качестве бронхолитического средства. Однако в последующем было показано, что терапевтически приемлемым свойством является его способность подавлять вирусную инфекцию и опухолевый рост. Как оказалось, противовирусные и противоопухолевые свойства реализуются через систему врожденного иммунитета, в частности через индукцию ИФН 1-го типа и провоспалительных цитокинов [256]. Эти данные в совокупности c первоначальной гипотезой о том, что имихимод является специфическим агонистом TLR7, позволили сформулировать вероятный механизм его действия [256, 260]. Учитывая, что имихимод является селективным агонистом TLR7, стало понятно, что преобладающим, если не единственным, путем переноса сигнала от эндосомы в ядро клетки является MyD88-зависимый путь [133]. Это полностью соответствует спектру продуцируемых им провоспалительных цитокинов: ИФНα, TNF-α, IL-1, -8, -12 и др. [114, 260, 316]. В общем виде схема сигналинга представлена на рис. 18.

Прямые доказательства MyD88-зависимого пути были получены на плазмацитоподобных дендритных клетках, которые экспрессируют практически только два TLR — TLR7 и TLR8 [93]. Авторами было показано, что в ответ на применение имихимода и резихимода клетки отвечали мощным выбросом ИФНα, а учитывая агонистические взаимоотношения имихимода и TLR7, можно полагать, что в основе лежит именно MyD88-зависимый путь. Кроме того, макрофаги от MyD88 и TLR-7-дефицитных мышей не отвечали на имидазолхинолин [133]. Это же мнение было поддержано и другими исследователями [2, 260].

Рис. 18. Возможные механизмы действия имихимода [2, 258, 259]

a — перенос сигнала и индукция синтеза провоспалительных цитокинов по MyD88-зависимому пути; б — перенос сигнала и синтез провоспалительных цитокинов по аденилатциклазному пути; в — проапоптозное действие имихимода.

Считается, что выработка ИФН 1-го типа — важный фактор противовирусного действия имихимода [241, 306]. В частности, было показано, что имихимод индуцирует ранний синтез цито-кинов. Максимальный пик секреции наблюдается через 2 ч после введения. После достижения максимальной концентрации цитокина в кровяном русле наблюдается постепенное снижение синтеза, и к исходу 12–24 ч их содержание не отличается от такового в контроле. Эти результаты позволили объяснить противовирусные свойства имихимода. Стало понятно, что он действует на вирус опосредованно, через индукцию интерферонов, изменяя течение и исход инфекционного процесса (см. рис. 18).

Вторым направлением MyD88-зависимого пути является вы-работка провоспалительных цитокинов (см. рис. 5 и рис. 18, а). Стоит отметить, что применение имихимода сопровождается стимуляцией не только ИФНα, но также IL-6, IL-8, MIP-1α, TNF-α [33, 260]. Наконец, MyD88-зависимый путь через активацию IRAK-киназ может активировать и интерферон-респонсивные молекулы, в частности IRF7, запуская синтез ИФН 1-го типа [234]

Иначе говоря, провоспалительная активность имихимода реализуется в первую очередь посредством MyD88-зависимого пути.

Исследуя возможные механизмы действия имихимода, M. P. Schön и соавт. [260] установили, что провоспалительные цитокины в дендритных клетках могут экспрессироваться и в отсутствие TLR7 рецепторов. Учитывая некоторое сходство имихимода с аденозином, было высказано предположение о возможности реализации провоспалительного действия имихимода через аденозиновые рецепторы [260]. Однако при этом возникает некоторая неопределенность, поскольку имихимод, как антагонист аденозиновых рецепторов и аденилатциклазы, должен был бы снижать провоспалительное действие, но этого не происходит.

Более того, именно провоспалительными свойствами препарата объясняется его противовирусное действие при заражении вирусом простого герпеса, в том числе клеток линии FL, несущих нефункциональные TLR7/8 [160]. Авторы показали, что противовирусное действие имихимода при герпесе может быть связано с экспрессией цистатина А — ингибитора цистеиновых проте-аз, который активируется в ответ на подавление А1. В этом же исследовании Y. Kan и соавт. [160] было показано, что цистатин А-зависимым действием в отношении вируса простого герпеса обладает только имихимод, но не резихимод.

Таким образом, в общих чертах механизм TLR7-независимого действия имихимода заключается в антагонистическом ингибировании аденилатных рецепторов А1 и аденилатциклазы (см. рис. 18, б). При этом в результате ингибирования А1, активируется цистатин А, оказывающий, по данным авторов, прямое вирулицидное действие на вирус простого герпеса (HSV), кроме того, не исключены экспрессия и высвобождение ИФН 1-го типа. Однако, по крайней мере по состоянию на 2017 г., точные механизмы взаимодействия имихимода и аденилатных рецепторов остаются не до конца изученными.

Третьими по порядку, но не по важности являются проапоптогенные свойства имихимода, выявленные исследователями, отметившими достоверное увеличение апоптозных клеток в ответ на применение имихимода в больших дозах [261]. При этом проникший в клетку имихимод активирует высвобождение из митохондрий цитохрома С при участии BcL2 пути (см. рис. 18, в). Конечным результатом этих событий является реализация эффекторных механизмов, позволяющих обойти резистентность опухоли через апоптозный сигналинг [263]. В присутствии имихимода высвободившийся цитохром С связывает белок, инициирующий апоптоз (Apaf 1). В результате связывания цитохрома С +Apaf + dATP формируется апоптосома, которая связывает прокаспазу c последующим ее высвобождением после специфического расщепления [60]. В свою очередь, каспаза-9 с помощью каспаза-3 расщепляющего сайта высвобождает каспазу-3 из ее протоформы [338], и уже зрелая каспаза-3 запускает непосредственно механизм апоптоза [52].

Таким образом, имихимод имеет, по меньшей мере, три механизма действия:

– MyD88-зависимый путь синтеза провоспалительных цитокинов;

– аденилатный путь синтеза провоспалительных цитокинов;

– апоптозный путь элиминации опухолевых клеток (см. рис. 18).

Итак, у специалистов, занятых исследованием и клиническим применением имихимода, сложилось единое мнение о том, что TLR7-сигналинг является ведущим механизмом реализации противовирусной и противоопухолевой активности имихимода [33, 155, 184, 260, 306 и др.]. При анализе всего массива литературы мы не нашли ни одного источника с иными выводами. Это стало понятно даже раньше, чем было установлено, что имихимод является агонистом TLR7 [129]. Как уже было отмечено, действие имихимода реализуется через индукцию, синтез и высвобождение провоспалительных цитокинов, в первую очередь ИФН 1-го типа, IL-1, -6, -8, -10, -12, TNF-α и других [114, 260, 316].

Влияние имихимода на продукцию провоспалительных цитокинов, в частности IL-6 и IL-8, было подтверждено in vitro в процессе культивирования иммортализованных эндотелиоцитов EA.hy 926, в присутствии различных концентраций имихимода. Как видно из данных табл. 5, имихимод дозозависимо стимулировал выработку IL-6 с высокой степенью достоверности. Аналогичным образом дозозависимо возрастала выработка IL-8, одна-ко связь между дозой и наблюдавшимся эффектом была не столь значительна и достоверных различий с контролем не получено, возможно вследствие относительно небольшой экспериментальной выборки (n=8).

При нанесении имихимода в виде 1 % или 5 % крема на кожу безволосых мышей в зоне обработки увеличивается выработка mRNA ИФНα и TNF-α. Кроме того, повышается содержание клеток Лангерганса в коже, которые при этом активируются и мигрируют в регионарные лимфоузлы и могут стимулировать презентацию антигена Т-клеткам [147].

Таблица 5. Высвобождение IL-6 и IL-8 в культуре эндотелиоцитов EA.hy 926 под действием имихимода in vitro

Примечание. ДМСО — диметилсульфоксид; звездочками отмечены достоверные отличия между контрольными и опытными лунками: *p<0,01; **p<0,05. Данные представ-лены в виде средней ± стандартное отклонение, n=8 [171].

В мононуклеарных клетках периферической крови человека, особенно в моноцитах, имихимод способен индуцировать про-дукцию цитокинов, включая ИФНα, TNF-α, IL-1, -6, -8, -10, -12, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), макрофагальный воспалительный белок-1А и макрофагальный хемотаксический белок (MCP-1), в результате активации факторов, связывающих промоторные регионы ИФНα и других цитокинов с последующей активацией транскрипции [70, 211]. Подтверждением способности вызывать индукцию ИФН могут служить исследования динамики синтеза ИФН у интактных белых мышей, которым однократно подкожно вводили препарат имихимода в дозах 0,5; 1 и 10 мкг/кг ( рис. 19). Через 1, 2, 4, 8 и 24 ч у животных брали кровь из ретробульбарного венозного сплетения, отделяли сыворотку, в которой определяли содержание ИФН методом биологического титрования [1]. Показано, что подкожное введение имихимода сопровождается отчетливым увеличением выработки ИФН, максимум которой приходится на 4 ч после введения препарата, при этом концентрация цитокина отчетливо зависела от дозы препарата. Максимальную продукцию цитокина наблюдали в ответ на введение 10 мкг/кг имихимода. Важно от-метить, что следовую активность ИФН, индуцированного имихимодом в дозе 10 мкг/кг, наблюдали до 24 ч.

В другом опыте этой серии мы оценивали влияние кратности введения имихимода на синтез ИФН. С этой целью, как и в работе M. J. Reiter и соавт. [241], препарат в дозе 10 мкг/кг вводили подкожно 1, 2, 3 и 4 раза с интервалом 2 ч. Титр ИФН оценивали через 2 ч после введения последней дозы каждой кратности. Как следует из данных рис. 20, многократное введение имихи-мода в течение 8 ч сопровождалось дозозависимым увеличением индукции ИФН. Максимальный уровень отмечен через 2 ч после введения четырех доз. Эти результаты подтверждают данные M. J. Reiter и соавт.

Рис. 19. Динамика содержания интерферона в сыворотке крови белых мышей при однократном подкожном введении разных доз имихимода

Сопоставление полученных данных с опубликованными ранее результатами демонстрирует высокую степень подобия. Наблюдающиеся различия могут быть объяснены отличиями в популяциях экспериментальных животных. В наших исследованиях, в отличие от работы M. J. Reiter и соавт. [241], были использованы не линейные, а беспородные мыши. Кроме того, препарат вводи-ли подкожно, а не перорально, и в меньших дозах. Наконец, в наших исследованиях и в работе M. J. Reiter и соавт. использовали разные методы титрования ИФН 1-го типа.

Имихимод способен опосредованно стимулировать продукцию ИФНγ — цитокина Т-хелперов 1-го типа (Th1) в культурах клеток селезенки и костного мозга мышей, а также в культуре мононуклеарных клеток периферической крови человека. Однако имихимод не стимулирует Т-клетки для последующей индукции Т-клеточных цитокинов, таких как IL-2, -4 или -5. Представляют интерес особенности активации имихимодом экспрессии ИФНγ. Так, показано, что имихимод увеличивает продукцию ИФНγ, IL-10 и эффекторную функцию Т-клеток в очаге плоскоклеточного рака, а также стимулирует продукцию перфорина и гранзима, которые опосре-дуют активность цитотоксических клеток. Вместе с тем, имихимод не влиял на продукцию ИФНγ нормальными клетками кожи [142].

Рис. 20. Концентрация ИФН при различной кратности подкожного введения имихимода в дозе 10 мкг/кг.

Мышам (по 10 в каждой группе) вводили имихимод 1, 2, 3 и 4 раза. ИФН титровали биологическим методом в сыворотке, взятой через 2 ч после введения последней дозы

ИФНα может индуцировать субъединицу В2 рецептора IL-12 и продукцию ИФНγ [313]. Таким образом, Th1-клетки могут быть главным источником ИФНγ, однако цитотоксические Т-клетки и натуральные киллерные клетки также могут продуцировать ИФНγ после стимуляции имихимодом. Продолжительная противовирусная защита после местной аппликации имихимода может быть связана со стимуляцией клеток Лангерганса в ответ на повышенные уровни ИФНα, ИФНγ, IL-10 и -12 [142, 188, 313].

Предполагалось, что имихимод может ингибировать продукцию Th2 цитокина —IL-5 в клеточных системах человека и мыши [313]. Однако позднее эти данные не нашли подтверждения. На-против, было показано, что имихимод не оказывал достоверного влияния на секрецию B-лимфоцитами (CD19⁺) провоспалительных цитокинов и хемокинов, таких как IL-1α, -1β, -6, -13, -8, и -10, TNF-α, MIP-1α, MIP-1β, MCP-1, IP-10 [15]. Данные подтверждают, что имихимод может быть полезен при лечении патологических состояний, при которых необходимо увеличение Th1-ответа, например при атопических заболеваниях [258].

При применении имихимода регресс бородавки, по-видимому, связан с индукцией локальных цитокинов и клеточной инфильтрацией, в совокупности приводящими к выработке клеточно-опосредованного иммунного ответа [66]. Несколько иные механизмы обеспечивают, по-видимому, противоопухолевое действие имихимода (см. рис. 19).

В механизме противоопухолевого действия имихимода, наряду с его провоспалительной активностью, важную роль занимают его цитотоксическое, проапоптозное и антиангиогенное свойства. Так, в результате связывания имихимода с TLR7 на плазмацито-подобных дендритных клетках, последние генерируют выработку большого количества провоспалительных цитокинов ( рис. 21), которые, в свою очередь, вызывают сильный Th1-клеточный иммунный ответ в виде стимуляции клеток Лангерганса, макрофагов, NK-клеток и цитотоксических Т-лимфоцитов (СТЛ), а также трансформированных противоопухолевых дендритных клеток [96, 240, 263, 280]. Среди возможных механизмов упоминается также индукция 2’5′-олигоаденилат синтазы, сопровождающаяся стимуляцией NK-клеток [220], и индукция перфорина в СТЛ [24], причем каждый из этих путей может внести свой вклад в противоопухолевую активность имихимода.

Рис. 21. Механизм противоопухолевого действия имихимода [263].

Этапы вовлечения опухолевой клетки в иммунный ответ, индуцированный имихимодом; в нижнем левом углу — структурная формула имихимода

Среди многочисленных свойств имихимода как иммуномодификатора большой интерес представляет его способность подавлять пролиферацию клеток, в первую очередь опухолевых [84, 193, 266, 267]. Описаны разные механизмы, лежащие в основе этого феномена. В работе S. Majewski и соавт. [193] было показано, что подкожное введение мышам клеток саркомы легкого индуцирует интенсивное прорастание сосудов в очаг опухоли. Если одновременно с инокуляцией опухолевых клеток на кожу наносили имихимод в виде 5 % крема, образование сосудов в зоне инокулята существенно замедлялось.

Эти данные были подтверждены in vitro на культуре иммортализованных эндотелиоцитов EA.hy 926. Клетки вносили в микропланшет, добавляя ростовую среду. После формирования конфлюэнтного слоя на дне планшета пластиковым шпателем удаляли полоску монослоя клеток шириной 0,5 мм, создавая бесклеточную зону, проходящую через центр лунки. Затем в лунки вносили имихимод в исследуемых концентрациях и инкубировали при 37 ˚С в течение 24 ч, после чего оценивали миграцию клеток в бесклеточную зону ( рис. 22). Как можно видеть, в контрольной лунке клетки активно мигрировали в бесклеточную зону, формируя равномерный пласт. Все клетки имели нормальную морфологическую структуру (см. рис. 22, в, г). При внесении в культуру клеток имихимода в концентрации 3,125 мкг/мл интенсивность миграции несколько снижалась. Пласт клеток не полностью заполнял зону миграции (см. рис. 22, и, к). Увеличение дозы имихимода до 6,25 мкг/мл уже больше подавляло миграцию. В просвете видны только единичные клетки (см. рис. 22, ж, з). При внесении в среду имихимода в максимальной дозе 25 мкг/мл миграция клеток была практически полностью подавлена (см. рис. 22, д, е). Следует подчеркнуть, что имихимод в испытанных концентрациях не оказывал какого-либо патологического влияния на клетки. При микроскопировании все клетки имели нормальную морфологическую структуру без каких-либо патологических повреждений.

Из представленных данных можно видеть, что имихимод оказывает, скорее всего, дозозависимое угнетение миграции клеток в бесклеточную зону. При количественной оценке индекса пролиферации установлено, что это угнетение было статистически достоверным при внесении в культуру клеток имихимода в дозе 12,5 мкг/мл, и особенно в дозе 25 мкг/мл (табл. 6 ).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что имихимод ингибирует функциональные реакции клетки, но не повреждает их. Этот вывод, сделанный на основе морфологического анализа, подтверждается результатами иммунохимических исследований. Так, при определении лигандсвязывающей активности клеток EA.hy 926 с помощью меченого биотином VEGF человека было показано, что обработка имихимодом не сопровождалась изменением способности связывать VEGF, а также не изменяла экспрессию CD44 рецептора, опосредующего контакты клеток с внеклеточным матриксом (табл. 7).

Рис. 22. Влияние имихимода на миграционную активность эндотелиальных клеток. Миграция клеток линии EA.hy 926 в зону механически поврежденного монослоя;

а, б — исходное положение после удаления клеток; в, г — спонтанная миграция эндотелиальных клеток после 24-часовой инкубации (контроль культуры клеток); д, е — в присутствии 25 мкг/мл имихимода в культуре клеток; ж, з — 12,5 мкг/мл имихимода; и, к — 6,25 мкг/мл имихимода. Приведены воспроизводимые результаты трех независимых экспериментов

Таблица 6. Зависимость пролиферации от дозы имихимода

Примечание. Различия между средними величинами индекса пролиферации в кон-трольных лунках (спонтанная пролиферация) и в присутствии тестируемых образцов статистически достоверны при: *p<0,01; **p<0,05

Таблица 7. Экспрессия фенотипических маркеров на поверхности эндотелиальных клеток под действием имихимода

Полученные результаты подтвердили имеющиеся в литературе данные о том, что имихимод способен ингибировать пролиферативные процессы, в том числе пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток, образующих выстилку сосудов, прорастающих в солидные опухоли. В этой связи было предпринято очень интересное исследование, в котором определяли влияние 5 % крема имихимода на рост сосудов в опухоль, индуцированную клетками кератиноцитарной линии Skv человека, трансплантированными в кожу боковых поверхностей облученных мышей в дозе 0,2510⁵ клеток, которые содержат интегрированные копии вируса папилломы серотипа 16 [193].

До и после индукции ангиогенеза в результате интрадермального введения опухолевых клеток кожу зоны инъекции обрабатывали 5 % кремом имихимода. Животным контрольной группы имихимод не применяли. Через 3 дня животных умерщвляли, отсепаровывали те участки кожи, в которых индуцировали ангиогенез, и подсчитывали число новообразованных сосудов. При исследовании внутренней поверхности кожи у контрольных животных было выявлено бóльшее число ветвящихся сосудов, имевших радиальную ориентацию относительно новообразования, чем в опытной группе. По-видимому, в основе этого процесса лежит активация выработки эндогенных цитокинов, в первую очередь IL-18 и ИФНγ [193].

Известно, что эти цитокины являются мощными антиангиогенными факторами [148, 209]. В то же время, существуют, по-видимому, и иные факторы, индуцируемые или активируемые имихимодом непосредственно в эндотелиальных клетках, способные замедлить их миграцию в опухоль. Вместе с тем, известно, что имихимод может оказывать влияние на популяцию путем индукции апоптоза. В работе М. Schön и соавт. [263] показано, что имихимод проявляет прямую туморспецифическую проапоптозную активность in vitro и in vivo по отношению к ряду кожных опухолей, в том числе к кожным метастазам злокачественной меланомы — агрессивной опухоли кожи. Показано, что резистентность метастазов меланомы к имихимоду in vivo корреспондирует резистентностью к индуцированному имихимодом апоптозу in vivo и in vitro.

Существование такого процесса убедительно показано при культивировании клеток нескольких клеточных линий в присутствии разных концентраций имихимода [208]. Клетки линий HeLa S3, HaCaT, A431 и McCoy выращивали до образования сплошного монослоя, а затем в культуру клеток добавляли имихимод в концентрациях 1, 10 и 100 мкг/мл, и клетки инкубировали в присутствии имихимода в течение 20 ч. После культивирования апоптозные клетки идентифицировали в TUNEL-тесте.

При микроскопическом анализе было показано, что в контроль-ном мононослое встречались только единичные клетки в фазе апоптоза. Число апоптозных клеток увеличивалось при внесении в питательную среду имихимода, причем это увеличение носило дозозависимый (1, 10, 100 мкг/кг) и временно́й характер. Так, при инкубации клеток А341 в течение 4 ч признаки апоптоза выявлены в отдельных клетках, но по мере увеличения времени инкубации число апоптозных клеток непрерывно нарастало, достигая максимума к 20 ч инкубации (срок наблюдения).

Точные механизмы проапоптозного действия имихимода требуют дополнительных исследований, однако уже известно, что данный процесс может развиваться независимо от TLR7-рецептора [22]. Показано, в частности, что клетки рака эндометрия могут вступать в апоптоз и в отсутствии иммуноцитов. Эти сведения позволили авторам предположить, что проапоптозное действие имихимода непосредственно связано с рекрутингом Всl-2 и увеличением экспрессии Bcl-2 и Bcl-xL (см. рис. 20). В то же время, признается, что инфильтрация опухоли иммунокомпетентными клетками усиливает противоопухолевую активность имихимода, подчеркивая тем самым комплексный характер противоопухолевой активности препарата, как это было сформулировано М. Schön и соавт. [263] еще в 2003 г. (см. рис. 22).

Эти данные были подтверждены нами в прямых опытах на культуре клеток EA.hy 926 (табл. 8). В микропланшет с монослоем клеток вносили имихимод в дозах 25 и 100 мкг/мл, через 24 ч культивирования окрашивали аннексином и с помощью проточного цитофлуориметра определяли число некротизированных и апоптозных клеток. Контролем служили клетки, культивировавшиеся в аналогичных условиях с добавлением 0,2 % диметилсульфоксида (ДМСО).

Таблица 8. Влияние имихимода на некроз и апоптоз клеток EA.hy 926

Примечание. ДМСО — диметилсульфоксид. Результаты представлены в виде сред-ней ± стандартное отклонение; * различие с контролем ( p <0,05).

Как следует из представленных данных, имихимод не оказывал влияния на процессы некроза, но дозозависимо активировал апоптоз. Таким образом, полученные данные еще раз подтвердили проапоптозный потенциал имихимода.

Фармакокинетика имихимода. Пероральный или парентеральный пути введения имихимода сопряжены со значительными побочными эффектами [243], вследствие чего единственным приемлемым методом применения остался местный.

Так как имихимод очень плохо растворяется в воде, что косвенно свидетельствует о его относительно низкой биодоступности, для улучшения последней производители генерического препарата вынуждены были несколько модифицировать состав готовой лекарственной формы, с тем чтобы улучшить технологию ее производства и повысить однородность дозирования. Вместе с тем, будучи агонистом TLR7, имихимод даже в сравнительно низких концентрациях проявляет свое действие через активацию синтеза ИФН 1-го типа и провоспалительных цитокинов, а также индукцию апоптоза и подавление ангиогенеза [193, 211, 259]. C учетом этих обстоятельств, наибольший интерес в плане исследования фармакокинетических свойств имихимода представляют изуче-ние параметров прохождения и метаболизации вещества, оцен-ка его накопления в месте аппликации, в данном случае в коже, а также динамика его циркуляции в крови и элиминации из орга-низма.

Определение пенетрации имихимода в кожу. Для определе-ния проникновения препарата в разные слои кожи растворы ими-химода в дозах 25; 50 и 250 мкг/мл наносили на поверхность эксплантата кожи, взятой с уха кролика, которое фиксировали в диффузионной камере Франца и инкубировали в течение 6 ч. Определение производили в трех слоях кожи: верхнем (striatum corneum), среднем (striatum granulosum) и глубоком (striatum spinosum). Как следует из представленных данных табл. 9, наибольшее количество имихимода содержится в наружном слое кожи, непосредственно контактирующем с раствором. По мере проникновения препарата в глубокие слои его концентра-ция снижается, и в глубоких слоях дермы, в рецепторной зоне, содержание имихимода уже не превышает 1 мкг/см² поверхности эксплантата (см. табл. 9). Тем не менее, этих концентраций пре-парата оказывается достаточно для развития местного противо-вирусного и противоопухолевого ответа, отмеченного у экспери-ментальных животных и в клинических исследованиях.

Оценка системной абсорбции 5 % крема имихимода при местном нанесении. На боковой поверхности тела морской свин-ки выбривали участок кожи размером 2×5 см (10 см²), на который наносили 200 мг имихимода в виде 5 % крема однократно на 6 ч или на тот же срок ежедневно в течение 5 дней. По окончании дозирования определяли содержание имихимода в пробах сыво-ротки и мочи. По результатам анализа методом ВЭЖХ ни в од-ной пробе крови или мочи следов имихимода выявлено не было. Учитывая, что нижний порог чувствительности использованного нами метода ВЭЖХ составляет 0,15 мкг/мл имихимода, можно сделать вывод, что его концентрация при системной абсорбции после местного применения в виде лекарственного препарата имихимода 5 % крема ниже порога чувствительности метода. Эти результаты полностью согласуются с данными интрадермального накопления (см. табл. 9). Если глубоких слоев кожи достигает не более 1,0 % от дозы препарата, нанесенной на кожу, можно легко рассчитать, что максимальное накопление имихимода в системном кровотоке не превысит одного или нескольких нг/мл. Это предположение нашло свое подтверждение в работе L. I. Harrison и сотр. [130], показавших, что в крови людей, получавших ими-химод в виде крема 5 %, максимальная концентрация в крови не превышала 0,091 ± 0,063 нг/мл при однократном нанесении крема на лицо в дозе 12,5 мг (по имихимоду) и 0,775 ± 0,698 при одно-кратном нанесении на поверхность руки в дозе 75 мг по имихи-моду (табл. 10).

Таблица 9. Содержание имихимода (мкг/см²) в разных слоях эксплантата кожи свиньи

Примечание. Результаты трех независимых экспериментов выражали в виде средней арифметической (М) ± стандартное отклонение (SD)

При сопоставлении С_max после однократной и многократной аппликации препарата Имихимод крем 5 % прослеживается тенденция зависимости концентрации имихимода от суммарной дозы, однако эта зависимость недостоверна, что свидетельствует об отсутствии кумуляции препарата в процессе курсового применения.

Нам не удалось определить наличие имихимода и его алкилированных метаболитов в моче морских свинок ввиду очень низкой их концентрации. В этом вопросе можно лишь опираться на данные литературы, свидетельствующие о том, что выделение метаболитов имихимода происходит через почки. Период полувыведения имихимода в организме человека составил 20 –30 ч после применения препарата [130].

Таким образом, имихимод в виде крема 5% характеризуется минимальной системной абсорбцией, отсутствием кумуляции и сравнительно быстрым выведением из организма. Подчеркнем еще раз, что в рецепторный слой дермы проникает не более 1 % от дозы препарата при его аппликации на кожу. Полученные результаты согласуются с данными литературы, указывающими на относительно низкую частоту системных побочных реакций, которые в большинстве своем носят умеренный характер и не за-висят от суммарной курсовой дозы [50, 86].

Таблица 10. Концентрация имихимода в сыворотке крови при однократном и многократном нанесении в виде 5% крема [130]

Примечание. Результаты трех независимых экспериментов выражали в виде средней арифметической (М) ± стандартное отклонение (SD)

Токсичность воспроизведенного препарата имихимода. В имеющейся литературе развернутых исследований по токсикологии имихимода найти не удалось, что, впрочем, не было столь удивительным. Такие данные чаще всего являются конфиденциальными и содержатся только в служебной документации, представляемой регулирующему органу при регистрации нового лекарственного средства. В этой связи нами было проведено полное исследование параметров токсичности воспроизведенного препарата Вартоцид в процессе его подготовки к официальной регистрации в качестве лекарственного средства.

Первоначально были определены параметры острой токсичности субстанции имихимода. С этой целью препарат вводили белым мышам 1 раз в день подкожно в течение 5 сут. Вводимые дозы препарата составили 0,01–100 мг/кг массы тела с шагом 10. На каждую дозу было взято по 5 мышей. По окончании курса введения препарата за животным наблюдали в течение 10 сут. В период введения имихимода и последующего 10-дневного наблюдения никаких особенностей поведения не обнаружено. Ни одно животное не погибло. После окончания срока наблюдения животных выводили из опыта декапитацией под нембуталовым наркозом, а внутренние органы и кожу в месте введения подвергали гистологическому исследованию. При этом не обнаружено каких-либо макро- и микро-скопических изменений в тканях сердца, печени, почек, головного мозга. В зоне введения препарата отмечена лимфоидно-макрофагальная инфильтрация подкожной клетчатки, без признаков отека и некроза. Таким образом, проведенные исследования показали, что краткосрочное подкожное введение имихимода белым мышам не приводило к каким-либо патологическим изменениям. Вместе с тем, учитывая, что препарат плохо растворим в воде и перед введением его пришлось предварительно растворять в диметилсульфоксиде, можно предположить, что такой эксперимент не в полной мере отражает параметры токсичности, тем более что лекарственной формой препарата является крем, содержащий имихимод в концентрации 5 %.

С учетом этого обстоятельства было проведено исследование острой токсичности 5 % крема Вартоцида на самцах и самках крыс с массой тела 100 г. С этой целью препарат наносили животным на выстриженный участок кожи спины площадью 10 см² таким образом, чтобы удельная доза препарата составила 10 г/кг массы тела. Поверхность обработанного участка закрывали марлевой повязкой и фиксировали лейкопластырем. Контрольным животным таким же образом наносили вазелин. За животными наблюдали 14 дней, определяя массу тела до опыта, а также на 7-й и 14-й дни наблюдения (табл. 11).

Аппликации Вартоцида не отразились на динамике массы тела подопытных животных, которая в обеих группах изменялась одинаково. При патоморфологическом исследовании животных после окончания срока наблюдения никаких патолого-анатомических или гистологических изменений выявлено не было. Аналогичные результаты получены при определении подострой токсичности (результаты не представлены).

Таблица 11. Динамика массы тела крыс на фоне местных аппликаций Вартоцида

Примечание. Результаты представлены в виде средней арифметической ± стандартное отклонение для n =5

Учитывая, что Вартоцид представляет собой воспроизведенный препарат, необходимо было сравнить его с оригинальным препаратом Aldara^®. Исследование проведено на морских свинках, которым на выбритый участок неповрежденной кожи размером 2×2 см с одного бока наносили оригинальный препарат Aldara^®, а с другой — воспроизведенный препарат Вартоцид. Процедуру повторяли 5 раз/нед, нанося препараты тонким слоем без последующего втирания. В течение всего срока наблюдения измеряли толщину кожной складки (табл. 12), а после завершения наблюдения участки кожи с места аппликации подвергали гистохимическому исследованию ( рис. 23).

Как видно из представленных данных табл. 12, динамика толщины кожной складки участков кожи, на которые наносили исследуемые препараты и мазевую основу, не зависела от вида препарата. Результаты, полученные при изучении острой токсичности, хорошо согласуются с аналогичными данными литературы. Так, исследования на животных острой дермальной и вагинальной токсичности многоразовых кожных аппликаций показали, что имихимод 5 % крем не повышал чувствительность, а всего лишь слегка раздражал ткани в месте аппликации. При повторном введении препарата у мышей отмечено только локальное раздражение кожи в области нанесения крема [273].

Таблица 12. Динамика изменений толщины кожной складки у морских свинок на фоне аппликаций

Примечание. Каждый препарат исследовали на двух животных

При нанесении исследуемых препаратов на выстриженную кожу спины морских свинок у всех животных в течение первой недели развивалась реакция избегания, проявлявшаяся вокализацией при контакте с обрабатываемыми участками кожи и втирании мазевых образцов. Данную реакцию, свидетельствующую о повышен-ной чувствительности и/или гипералгезии, наблюдали только на участках кожи, подвергавшихся обработке исследуемыми препара-тами, она сохранялась на протяжении всего эксперимента. Одно-временно с гипералгезией наблюдали гиперемию кожи, наиболь-шую интенсивность которой отмечали у животных, получавших препараты Aldara^® и Вартоцид (см. рис. 23).

Рис. 23. Вид кожного покрова морских свинок:

а, б, в — через 7 дней (5 аппликаций и 2 дня отдыха); г, д, е — через 14 дней (10 аппликаций); ж, з, и — через 42 дня (30 аппликаций, точка завершения эксперимента); б, д, з — наложение Aldara^®, в, е, и — Вартоцида; а, г, ж — плацебо; б, в, д, е, з, и — видна интенсивная десквамация, гиперемия кожных покровов практически отсутствует

К концу 2-й недели на местах аппликации исследуемых препаратов развилась десквамация эпидермиса (см. рис. 23, д, е).

На 3-й неделе на участках аппликации препаратов Aldara^® и Вартоцид появились глубокие геморрагические пятна, а спустя 1 нед на этих же участках определялись мелкие очаговые уплотнения, обусловленные, возможно, образованием подкожных ин-фильтратов, спаянных с кожей. К концу срока наблюдения эти инфильтраты подверглись инволюции. К окончанию срока наблюдения макроскопическая картина на участках аппликации препа-ратов стабилизировалась, но не нормализовалась. По-прежнему сохранялись явления гипералгезии и интенсивной десквамации (см. рис. 23, з, и), в то время как интенсивность гиперемии уменьшилась, а инфильтраты, как уже было сказано, рассосались.

При макроскопическом исследовании поверхностей кожи отмечено повышенное слущивание эпидермиса на участках аппликации лекарственных препаратов, но не мазевой основы. По окончании срока исследования проведено микроскопическое изучение участков обработанной кожи ( рис. 24). При гистологическом исследовании образцов кожи, взятых из участков аппликации плацебо или исследуемых препаратов, установлено, что продолжительное применение препаратов не приводило к развитию патологических изменений в коже и подкожной клетчатке.

Гистологическое исследование показало наличие гидропической дистрофии с перераспределением ядерного хроматина, умеренно выраженного отека и слабой диффузной мононуклеарной воспалительной клеточной инфильтрации подлежащего стромального компонента. В бóльшей степени эти изменения развивались в коже, подвергавшейся воздействию препаратов Aldara^® и Вартоцид, что вполне соответствует данным гистологических исследований, полученных в экспериментах и при терапевтиче-ском применении препаратов имихимода в клинических условиях. В целом эти результаты свидетельствуют о том, что продолжительный курс имихимода в виде крема не приводит к развитию патологических изменений в коже, хотя и вызывает незначительный отек подкожной клетчатки. Учитывая, что имихимод обладает проапоптозным свойством и на этом феномене в определенной степени основано его противоопухолевое действие [164, 259], нами было проведено гистохимическое исследование экспрессии проапоптозного рецептора р53 в многослойном плоском эпителии. Как видно из рис. 25, имихимод в исследованных лекарственных формах существенно усиливает экспрессию рецептора р53, причем это усиление прослеживается как по площади, так и по интенсивности экспрессии.

Учитывая, что имихимод способен проникать не только в многослойный плоский эпителий, но и в подкожную клетчатку, был проведен аналогичный анализ подкожной стромы ( рис. 26 ). Как видно из представленных данных, общие закономерности экспрессии р53 в субэпителиальной строме аналогичны выявленным в многослойном плоском эпителии. Различия касаются только абсолютных цифр, что вполне понятно, поскольку многослойный плоский эпителий и подлежащая строма образуют единое пространство кожи, имеющее морфологические различия, но объединенное единством функции защиты внутренней среды организма от воздействия внешних факторов.

Рис 24. Микрофотографии участков кожи морских свинок после местного применения:

а — плацебо, многослойный плоский эпителий типового строения с умеренно выраженным кератозом, слабым очаго-вым акантозом, слабо выраженными дистрофическими изменениями преимущественно верхних отделов и наличием небольшого числа мел-ких кист, слабо выраженным отеком подлежащего стромального ком-понента со слабой диффузной мононуклеарной воспалительной кле-точной инфильтрацией, с незначительной примесью нейтрофильных гранулоцитов; б — Aldara^®, многослойный плоский эпителий типового строения с умеренно выраженным кератозом, очаговым акантозом и на-личием небольшого числа мелких кист, умеренно выраженным отеком подлежащего стромального компонента с наличием единичных клеток мононуклеарного ряда; в — Вартоцид, многослойный плоский эпителий типового строения с умеренно выраженным кератозом, очаговым аканто-зом, слабо выраженными дистрофическими изменениями, умеренно вы-раженным отеком подлежащего стромального компонента с диффузной мононуклеарной воспалительной клеточной инфильтрацией

Исходя из полученных данных, можно считать, что исследованные образцы крема имихимода близки между собой как по показателям безопасности, так и по индуцируемым эффектам, в том числе по индукции апоптоза в зоне аппликации, по крайней мере по показателю экспрессии проапоптозного рецептора р53.

Рис. 25. Результаты гистохимического определения экспрессии р53 в многослойном плоском эпителии кожи морских свинок после 6-недельной аппликации препаратов.

a — площадь окрашенных участков (количественная характеристика экспрессии р53); б — оптическая плотность (интенсивность окраски, относительная интенсивность экспрессии на каждом участке)

Рис. 26. Результаты гистохимического определения экспрессии р53 подкожной клетчатке морских свинок после 6-недельной аппликации препаратов (обозначения те же, что и на рис. 25)

Совокупность результатов приведенного сравнительного исследования показала, что препарат Вартоцид удовлетворительно воспроизводит фармакологическую активность, присущую оригинальному препарату Aldara^®. Наблюдающиеся различия недостоверны.

Канцерогенез, мутагенез, эмбриотоксичность. При исследовании имихимода было условлено, что максимальная рекомендованная доза для человека (МРДЧ) составляет 25 мг субстанции, или 500 мг крема 5 %. Дозирование препарата животным проводили с учетом различий в площади поверхности тела (дозы приводили к показателю МРДЧ методом AUC-сравнения). Во всех исследованиях дозирование на животных проводили с учетом правил масштабирования.

При исследовании канцерогенности крысам линии Wistar препарат вводили перорально 2 раза в нед (до 6 мг/кг в день) или ежедневно (3 мг/кг в день) в течение 24 мес. У животных не выявлено никаких опухолей, обусловленных введением Вартоцида, при введении по разным схемам, вплоть до самых высоких доз:

– 6 мг/кг 2 раза/нед самкам крыс;

– 4 мг/кг 2 раза/нед самцам крыс;

– 3 мг/кг 7 раз/нед самкам и самцам крыс.

При исследовании канцерогенности в условиях накожной аппликации Вартоцид наносили на кожу задних конечностей мышей в виде крема 5 % 3 раза/нед в течение 24 мес. Статистически достоверное увеличение случаев опухолей было отмечено только у мышей-самцов, получавших 251 МРДЧ.

В 52-недельном исследовании на модели фотоканцерогенеза было отмечено сокращение среднего времени формирования опухоли у мышей с эпилированной кожей в течение хронического облучения ультрафиолетовыми лучами (5 дней/нед, 40 нед) с одновременным местным применением плацебо (3 раза/нед, 40 нед, оценка результатов через 12 нед наблюдения после окончания курса плацебо). Не отмечено ускорения развития опухолевого процесса при применении имихимода 5 % крема для наружного применения по сравнению с аналогичным процессом, наблюдавшимся при использовании плацебо. Имихимод не показал никаких мутагенных или канцерогенных свойств. В пяти исследованиях генотоксичности (AMES-исследование на клетках мышиной лимфомы L5178Y, в тесте хросомных аберраций на клетках яичника китайского хомячка, в тесте хромосомных аберраций лимфоцитов человека) и реакции трансформации SHE-клеток не выявлено мутагенного или кластогенного действия Вартоцида. Не отмечено генотоксичности и в трех тестах in vivо (кры-сы, костный мозг хомяка и мыши, доминантный летальный тест). Ежедневное пероральное введение Вартоцида крысам в период спаривания, беременности, родов и выкармливания не выявило какого-либо действия на рост, эмбриогенез или репродуктивность в дозах до 87 МРДЧ.

Общее исследование репродукции у крыс на фоне применения Вартоцида у самок и самцов до и во время брачного периода, а так-же во время беременности и лактации у самок показало наличие клинических признаков токсичности у обоих родителей. Однако не было отмечено влияния на репродуктивные характеристики. Не наблюдали никаких побочных эффектов имихимода в отношении средней продолжительности беременности, среднего размера помета или числа мертвых щенков. Выживание детенышей и рост в период лактации были в норме. При скрещивании потомства не обнаружено никаких побочных эффектов, относящихся к их ре-продуктивной функции. У крыс и кроликов, получавших имихимод, не обнаружено тератогенных изменений. У крыс при введении высокой материнской токсической дозы (28 человеческих доз в расчете мг/м² поверхности тела) была редуцирована масса тела детенышей и замедлена оссификация. В исследованиях развития потомства от беременных крыс, обработанных имихимодом (8 человеческих доз), не установлено никаких негативных последствий. Имихимод тестировали на мутагенность в различных исследованиях in vitro и in vivo. Никакой мутагенной активности ни в одном тесте обнаружено не было [273].

Исследования влияния Вартоцида на течение беременности и развитие эмбрионов проводили на крысах и кроликах. Препарат вводили беременным крысам перорально в дозах 1; 5 и 20 мг/кг в день в течение периода закладки органов (6 –15-й день гестации). Неблагоприятные эмбриональные явления отмечены только в случае применения имихимода в дозе 20 мг/кг в день. Они проявлялись увеличением резорбции, уменьшением массы тела эмбрионов, задержкой окостенения скелета, деформацией костей, у 2 эмбрионов из 1 567 наблюдавшихся отмечено увеличение языка, низкое расположение ушей. Не выявлено никакой эмбрио-фетальной токсичности и тератогенности при введении Вартоцида в дозе 50 мг/кг в день.

Внутривенно Вартоцид вводили беременным крольчихам в дозах 0,5; 1 и 2 мг/кг в день в период эмбриогенеза (гестаци-онный период 6 –18-й день). Не выявлено никаких зависимых от препарата эмбриофетальных и тератогенных эффектов при введении максимальной в этом эксперименте дозы Вартоцида, составлявшей 2 мг/кг в день, или половинной дозы (1 мг/кг в день).

В исследованиях на крысах проводили сравнительную оцен-ку влияния Вартоцида на эмбриотоксичность, а также на пери- и постнатальное развитие. Препарат вводили перорально крысам-самцам в дозах 1; 1,5; 3 и 6 мг/кг в день за 70 дней до спаривания и в период спаривания, крысам-самкам препарат вводили в тех же дозах с 14-го дня до спаривания и в период беременности, родов и лактации. Никакого влияния препарата на рост и развитие эмбриона, воспроизводство или послеродовое развитие не было отмечено при всех испытанных дозах, вплоть до максимальной, составлявшей 6 мг/кг в день. При отсутствии материнской ток-сичности были отмечены некоторые изменения в костном скелете эмбриона при введении препарата в дозе 6 мг/кг в день.

Не выявлено никаких тератогенных эффектов у животных, которым имихимод вводили в дозе 3 мг/кг в день.

Завершая описание токсичности имихимода как непосредственно исходной субстанции, так и фармакологических препаратов оригинального, производимого под брендом Aldara^®, и воспроизведенного аналога Вартоцида, можно с достаточным основанием утверждать, что оба препарата 5 % крема имихимода (Aldara^® и Вартоцид) являются полностью безопасными и проникают в системный кровоток в следовых количествах. Оба препарата обладают низкой токсичностью при парентеральном и накожном применении, а также не обладают генотоксичностью, эмбриотоксичностью и не влияют на течение и исход беременности.

При длительной накожной аппликации отмечается слабая реакция эпидермиса, проявляющаяся повышением слущивания рогового эпителия и незначительным отеком подкожной клетчатки, причем наблюдаемые изменения не зависят от вида препарата (оригинального или воспроизведенного).

Сопоставление эффективности оригинального препарата Aldara^® и воспроизведенного препарата Вартоцид по такому важному для онкологии показателю, как способность индуцировать апоптоз, показало, что по этому свойству они близки между собой. Отметим также сходство препаратов и по влиянию на выработку провоспалительных цитокинов. И хотя прямых сравнительных исследований провоспалительной активности по ряду причин нам провести не удалось, тем не менее, сопоставление полученных результатов с данными литературы позволяет уверенно утверждать, что оригинальный и воспроизведенный препараты если и неидентичны, то весьма близки между собой. Учитывая провоспалительную природу препаратов имихимода, следовало ожидать развития тех или иных неблагоприятных эффектов в зоне аппликации препарата. Такие побочные эффекты действительно наблюдаются, однако их, на наш взгляд, уместнее обсуждать при описании конкретных нозологических форм, при которых показа-ны данные препараты, что сделано в последующих главах.