ВАРТОЦИД (имихимод). Глава 2

Глава 2. Физико-химические свойства и некоторые аспекты синтеза

Из истории имидазолхинолинов. Создание кольца имидазол-[4,5-c]-хинолина впервые описано O. G. Backeberg и соавт.

В 1938 г. [36]. Однако результаты, описанные и в этом, и в следующем сообщении тех же авторов [37], были спустя несколько лет опровергнуты в работе E. Koenigs, J. Freund [167] на основании более точного анализа структуры полученных продуктов.

Первым корректно описанным синтезом 1Н-имидазол[4,5-с]-хинолина  считается  работа  G. V.  Bachman  и  соавт.  [35], в которой приведено получение и применение в качестве противомалярийного препарата 1-(6-метокси-8-хинолинил)-2-метил-1Н-имидазол[4,5-с]-хинолина.

А. R. Surrey и соавт. [288] синтезировали 3-нитро- и 3-амино-4-диалкиламино-алкиламинохинолины      для     использования в качестве противомалярийных и антибактериальных препаратов.

Свойствами антиконвульсанта и препарата для лечения сердечно-сосудистых заболеваний обладал синтезированный [2-(4-пиперидил)этил]-1Н-имидазол[4,5-с]-хинолин.

Европейский патент EP-A-145,340 заявил 1Н-имидазол[4,5-с]-хинолины в качестве бронходилататоров, а 1Н-имидазол[4,5-с] хинолина-4-амин — как противовирусное средство.

Приведенные выше примеры показывают, что химия имидазолхинолинов достаточно интересна, а их биологическое действие может распространяться на ЦНС, сердечно-сосудистую систему, а также на бактериальные и вирусные инфекции.

Строение, физические и химические свойства. Представитель класса имидазолхинолинов имихимод имеет структуру, представленную на рис. 7.

IUPAC: 1-(2-метилпропил)-1Н-имидазол[4,5-с]-хинолин-4-амин. Брутто формула — C₁₄H₁₆N₄, MW-240, 304 Da, твердое вещество белого цвета. Растворим в DMSO: 3 mg/mL, в H₂O: < 1 mg/mL, в EtOH: < 1 mg/mL; растворим в жирных кислотах, T_пл — 294 ºС, LogP — 3.457, pKa —7.3.

Спектр ( рис. 8) имеет типичные полосы поглощения с характеристическими частотами соответствующих функциональных групп: 566, 693, 759 (С-Н ароматическая связь), 1034, 1183, 1396, 1465, 1530, 1583, 1647, 1696, 3096 (-NH₂), 3178 (ароматическая связь), 3333 (N-H).

Данные ЯМР-спектроскопии приведены на рис. 9. Спектр снят в дейтерированном диметилсульфоксиде при 300 MHz. В процессе снятия спектра были получены следующие сигналы:

– 0,9 м. д. синглет (-CH₃);

– 2,2 м. д. мультиплет (-N-CH₂-CH-(CH₃)₂);

– 4,4 м. д. дуплет (-N-CH₂-CH-(CH₃)₂);

– 6,5 м. д. синглет (-NH₂);

– 7,2 м. д.; 7,4 м. д. триплет (-CH-) у 7 и 8 атомов углерода хинона;

– 7,6 м. д.; 8,0 м. д. дуплет (-CH-) у 6 и 9 атомов углерода кольца хинона;

– 8,1 м. д. синглет (-CH-) у 2 атома углерода имидазольного кольца.

Рис. 7. Структурная формула имихимода

Рис. 8. ИК-спектр имихимода.

Приведен инфракрасный спектр препарата, снятый в диске с KBr (1,0 мг препарата в 300,0 мг KBr) в области от 4000 до 400 см^–1

Рис. 9. Спектр протонного магнитного резонанса имихимода

Данные ПМР-спектроскопии в хлороформе:

¹H-NMR (CDCl₃) δ 1.08 (d, 6H); 2.37–2.43 (m, 1H); 4.41 (d, 2H); 7.73 (ddd, 1H, J₁=7.0 J₂=8.5 J₃=1.5 Hz); 7.68 (ddd, 1H, J₁=7.0 J₂=8.3 J₃=1.3 Hz); 8.09–8.13 (m, 2H); 8.22–8.27 (m, 1H).

Таким образом, результаты исследования методом протонного магнитного резонанса показали, что химические сдвиги сигналов протонов соответствуют структуре вещества C₁₄H₁₆N₄.

Синтез. В настоящее время известно четыре схемы получения субстанции имихимода.

Первая схема, представленная на рис. 10, начинается с реакции хинолина (2) с хлороксидом фосфора, в ходе которой ОН-группа в положении 4 замещается на Cl (соединение 3). Далее проводят реакцию с изобутиламином в присутствии триэтиламина. Полученное соединение (4) восстанавливают в толуоле методом каталитического гидрогенолиза на платиновом катализаторе (Pt/C) с получением дизамещенного хинолина (5), имеющего аминогруппы в положениях 3 и 4. На следующей стадии реакция c триэтилортоэфиром приводит к замыканию кольца и получению 1Н-имидазол[4,5-с]-хинолинового производного (6). По-следующее окисление атома N в пятом положении и введение Cl хлороксидом фосфора приводит к соединению (1), которое после обработки аммиаком в метаноле дает имихимод. К недостаткам этой схемы можно отнести большое число нитросоединений (2, 3, 4 и 7), которые, как известно, требуют обеспечения особой пожаро- и взрывобезопасности процесса.

Вторая схема синтеза имихимода ( рис. 11) начинается с нитрования соединения (9) с последующим введением двух атомов хлора в положения 2 и 4 соединения (10), с получением 2,4-дихлор-нитрохинолина (11). Реакция с изобутиламином позволяет получить промежуточный продукт (12). Далее следует восстановление нитрогруппы в положении 3, с последующей конденсацией хинолина, имеющего аминогруппы в 3 и 4 положениях (13), который после реакции с триалкилортоэфиром дает 4-хлор-1Н-имидазол [4,5-c]хинолин (1). Соединение (1) обрабатывают аммиаком в метаноле с получением имихимода. Этот метод также является сложным и трудоемким, а неоднократное использование нитропроизводных (10, 11 и 12) включает вышеупомянутые риски.

Рис. 10. Первая схема получения имихимода

Третья схема синтеза ( рис. 12) представлена в патенте № WO 97/48704. Процесс включает получение промежуточного продукта (15), которое требует, в частности, использования азотной кис-лоты и азида натрия. Это соединение, а также другие промежуточные продукты, характеризуется одновременным присутствием нитрогруппы и тетразольного кольца. Как известно, подобное сочетание функциональных групп делает молекулу нестабильной, а само вещество — взрывоопасным. Кроме того, эти синтезы также являются длительными и трудоемкими.

Рис. 11. Вторая схема получения имихимода

Рис. 12. Третья схема получения имихимода

Четвертый, лабораторный способ получения имихимода, предложенный в патенте EP 1529781 A1, основан на реакции 1-изобутил-1,5-дигидро-имдазо[4,5-a]-хинолин-4-она с хлорирующим агентом ( рис. 13).

Готовая лекарственная форма — крем Вартоцид. Главной целью при разработке Вартоцида (имихимод крем 5 % для на-ружного применения) было создание доступного препарата для лечения аногенитальных бородавок в виде фармацевтической композиции в лекарственной форме «крем для местного применения», содержащей комбинацию имихимода, олеиновой кисло-ты и моноэтилового эфира диэтиленгликоля, обладающей высоким терапевтическим эффектом вследствие хорошей чрескожной проникающей способности, отсутствием аллергических реакций, стабильностью при хранении. Эти качества достигаются за счет оптимального соотношения компонентов и совершенствования технологии изготовления.

Рис. 13. Четвертая схема получения имихимода

Имихимод представляет собой планарную ароматическую молекулу, которая обладает свойством образовывать межмолекулярные связи за счет стекинг-взаимодействия. Сильные межмолекулярные связи и способность к стекингу делают имихимод нерастворимым в воде и большинстве органических растворите-лей. Стоит отметить, что растворы имихимода также крайне не-стабильны из-за образования межмолекулярных ассоциатов, которые с течением времени выпадают в осадок.

Разработка способа доставки имихимода к различным слоям дермы является очень сложной задачей из-за его крайне низкой растворимости в большинстве фармацевтически приемлемых растворителей и плохой кожной проницаемости.

Вследствие вышеуказанных свойств лекарственная форма имихимода может быть создана в виде эмульсионной композиции. Такие композиции типа «масло в воде», содержащие имихимод, могут быть получены путем приготовления масляной фазы — растворения имихимода в жирной кислоте с последующим добавлением воды. Содержание воды в фармацевтической композиции может составлять 45–85 %. Стоит отметить, что со-держание воды в составе крема не должно быть высоким, так как в эмульсии молекулы имихимода будут избыточно контактировать с молекулами воды с образованием водородных связей между ними. Это может привести к образованию межмолекулярных ассоциатов с их последующим осаждением.

Для достижения желаемого клинического эффекта имихимод, применяемый местно, должен пройти сквозь верхние слои кожи и взаимодействовать с клетками эпидермиса. Это является сложной задачей, поскольку, несмотря на маленькую молекулярную массу, имихимод плохо проникает через кожу, вероятно из-за очень низкой растворимости в роговом слое и нижележащих тканях. Эпидермальная концентрация, необходимая для терапевтической эффективности имихимода, в настоящее время неизвестна. Исследования на культурах клеток показали, что самая низкая эффективная концентрация, индуцирующая продукцию цитокинов, составляет 0,1– 0,5 мкг/мл [211], в то время как высокие концентрации (25–50 мкг/мл) обладают прямой проапоптозной активностью [263].

Для подбора оптимального состава готовой лекарственной формы было проведено исследование растворимости субстанции имихимода в различных фармацевтически приемлемых растворителях. Растворы были получены после 24-часового перемешивания на магнитной мешалке при комнатной температуре, после удаления нерастворившегося остатка. Количество растворившегося вещества определяли методом ВЭЖХ с использованием ко-лонки С18. Самая высокая растворимость имихимода отмечена в олеиновой кислоте — 74 мг/мл (табл. 2). В случае использования полиэтиленгликолей (ПЭГ) растворимость линейно возрастала с ростом молекулярной массы [299].

I. Telo и соавт. также исследовали чрескожное проникновение имихимода из его насыщенных растворов на различных моделях — цельная свиная кожа, кожный лоскут — эпидермис и дерма, изолированная дерма. Полученные после 6-часовой аппликации соответствующего насыщенного раствора результаты приведены в табл. 3. Из данных таблицы видно, что проникновение имихимода в различные слои кожи во многом определяется проникающей способностью растворителя, то есть его ведущей ролью в проникновении и удержании имихимода в различных слоях кожи.

Таблица 2. Растворимость субстанции имихимода в различных растворителях

Таблица 3. Содержание имихимода в дермальных моделях после 6-часовой аппликации насыщенных растворов [299]

На основании приведенных данных литературы было принято решение использовать в качестве основного растворителя для имихимода олеиновую кислоту, а в качестве вспомогательного — моноэтиловый эфир диэтиленгликоля, обладающий проводниковыми свойствами. Таким образом, лекарственная форма в виде крема должна содержать комбинацию имихимода, олеиновой кислоты и моноэтилового эфира диэтиленгликоля, обладать высоким терапевтическим эффектом, хорошей чрескожной проникающей способностью, отсутствием аллергических реакций, стабильностью при хранении за счет оптимального соотношения компонентов.

Олеиновая кислота — одноосновная ненасыщенная карбоновая кислота, бесцветная вязкая жидкость, температура кипения 225–226 ºС (10 мм рт. ст.), плотность 0,825 г/см³ (20 ºС). Полу-чают олеиновую кислоту главным образом из оливкового масла, в котором содержание её достигает 70 –85 %. Она легко растворяется в этаноле, не растворяется в воде, хорошо смешивается с маслами в любых пропорциях, совместима с пропиленгликолем, лецитином, пальмитиновой, стеариновой и линолевой кис-лотами, фосфолипидами, витаминами (в том числе Е и А), керамидами. Олеиновая кислота в здоровой коже находится в балансе с линолевой кислотой в соотношении 1,4:1. В отличие от линолевой кислоты, которая проникает в кожу быстро, но неглубоко, олеиновая кислота проникает в глубокие ее слои, но не очень быстро, что делает ее идеальной основой лекарственных форм в виде крема для местного применения.

Моноэтиловый эфир диэтиленгликоля — современный транскутанный проводник, обладающий высокими проводниковыми свойствами, что обеспечивает дозированную доставку имихимода через кожу вглубь тканей и благодаря своей высокой растворяющей способности выполняет роль эффективного связующего для прочих компонентов готовой лекарственной формы. Моно-этиловый эфир диэтиленгликоля обладает также важным свой-ством дозированного высвобождения введенных вглубь тканей активных веществ (в нашем случае имихимода). Транскутанные свойства моноэтилового эфира диэтиленгликоля в 2,5 раза выше, чем у диметилсульфоксида, он не вызывает аллергических реакций и не обладает столь резким запахом. Применение моноэтилового эфира диэтиленгликоля в приготовлении основы крема Вартоцид обеспечивает очевидные преимущества как с точки зрения физико-химических характеристик готовой формы, так и с точки зрения характеристик высвобождения и абсорбции препарата.

В частности, моноэтиловый эфир диэтиленгликоля особенно эффективно повышает абсорбцию активного ингредиента благодаря своей способности растворять дермальный липидный барьер, обладает пленкообразующими свойствами.

Таким образом, выбор олеиновой кислоты и моноэтилового эфира диэтиленгликоля в качестве растворителей для субстанции имихимода и в составе крема Вартоцид научно обоснован. Со-став готовой лекарственной формы крема Вартоцид (на 1 г) при-веден ниже.

Устойчивость эмульсионных систем. На последующих эта-пах оценивали устойчивость созданного эмульсионного крема Вартоцид в сравнении с имеющимися аналогами — оригинальным препаратом Aldara^® и воспроизведенным аналогом Кераворт.

В фармацевтической промышленности предъявляются жесткие требования к стабильности эмульсий. Под этим в основном подразумевается коллоидная стабильность — отсутствие расслаивания эмульсионной композиции при центрифугировании — и термостабильность — отсутствие расслаивания при длительном нагревании [53].

В эмульсиях могут происходить следующие процессы:

– прямая или обратная седиментация;

– флокуляция;

– обращение фаз;

– коалесценция;

– Оствальдово созревание [297].

Процесс седиментации происходит под влиянием внешних сил — гравитационных и центробежных. Наблюдается осаждение или всплытие капель эмульсии. Седиментационная устойчивость характеризует способность дисперсной фазы сохранять равномерное распределение частиц дисперсной фазы по всему объему. Седиментационная устойчивость эмульсии определяется в первую очередь размером частиц. Чем меньше размер капель, тем больше они участвуют в броуновском движении и седиментации практически не подвергаются.

Флокуляция — объединение двух и более капель в агрегаты, является следствием действия вандерваальсовых сил, которые обратно пропорциональны расстоянию между каплями.

Обращение фаз, то есть изменение типа эмульсии от «масло в воде» до «вода в масле» и наоборот, может происходить при изменении факторов, влияющих на гидрофильно-липофильный баланс, или при изменении концентрации раствора в дисперсной фазе.

Коалесценция представляет собой процесс слияния нескольких капель эмульсии, при котором выделяются в чистом виде отдельные компоненты эмульсии. При соприкосновении двух капель их поверхностная пленка истончается и разрывается, в результате чего капли объединяются вместе, при этом часть их содержимого выделяется наружу [296].

Сравнительное микроскопическое исследование Варто-цида, оригинального препарата Aldara^® и воспроизведенного аналога Кераворта. С целью изучения степени дисперсности крема Вартоцид было проведено его микроскопическое исследование в сравнении с оригинальным препаратом Aldara^® и воспроизведенным аналогом Керавортом (табл. 4, рис. 14). Из приведенных микрофотографий можно сделать вывод об идентичности эмульсий препарата Аldara^® (а) и Вартоцид (в). Степень диспергирования жировой фазы для обоих препаратов одинакова, раз-мер капелек дисперсной фазы составляет менее 5,0 мкм. Степень флокуляции для этих проб незначительна и не различается от препарата к препарату. Малый размер капелек жировой фазы обеспечивает эмульсиям высокую седиментационную устойчивость. Эмульсия препарата Кераворт менее однородна, размер капелек дисперсной фазы для составляет 5–10 мкм, при этом наблюдается небольшое количество слипшихся, агрегировавших капелек жировой фазы.

Таблица 4. Характеристика оригинального (Aldara^®) и воспроизведенных препаратов (Кераворт, Вартоцид) 5% крема имихимода

Рис. 14. Дисперсность препаратов Aldara^® (а), Кераворт (б), Вартоцид (в), производимых в виде 5 % эмульсионного крема типа «масло в воде».

Таким образом, физико-химические исследования показали, что воспроизведенный препарат Вартоцид по этим параметрам полностью соответствует оригинальному прототипу и, учитывая приведенные в последующих главах результаты изучения биологической и клинической эффективности, с достаточным основанием может быть признан соответствующим препарату Aldara^®.

Внутриклеточные мишени имихимода. Для липофильных, гидрофобных соединений, имеющих внутриклеточный рецептор, всегда крайне актуален вопрос о проникновении вещества в клетку. Исследования на плазмацитоподобных дендритных клетках (для которых TLR7 и TLR8 являются единственными экспрессируемыми молекулами из семейства TLR) показали, что имихимод концентрируется в LAMP1+СD63+HLA-DR+ эндосомах. Белки LAMP1 и СD63 представляют собой маркеры поздних эндосом и лизосом, для которых характерен кислый pH. У плазмацито-подобных дендритных клеток эндолизосомальный компартмент специализирован на антигенной презентации через MHCII, по-этому можно сказать, что имихимод локализуется в MНC. Но так как имихимод представляет собой слабое основание, способное к пассивной диффузии сквозь клеточную мембрану, высказа-но предположение, что в начале имихимод пассивно проникает в клетку, после чего аккумулируется в MНC, где протонируется и уже не выходит наружу [252].

Как уже говорилось выше, имихимод является агонистом TLR7. Рецептор представляет собой трансмембранный белок с внутриклеточной локализацией на мембране эндосомы. TLR7 экспрессируется, главным образом, в легких, головном мозге, же-лудке, плаценте, а также в мононуклеарных клетках перифериче-ской крови, таких как дендритные клетки, моноциты, макрофаги и В-лимфоциты [293]. В организме человека этот белок состоит из 1049 аминокислот, сгруппированных в эктодомен с 27 лей-цин-богатыми регионами (LLR), трансмембранный домен и ци-тозольный TIR домен рецептора [192]. Эктодомен располагается внутри эндосомы. В процессе активации рецептора эктодомен подвергается воздействию кислого pH, отщепляется и перемеща-ется в ядрышко [199]. Активация TLR7 вообще сильно зависит от протеолитических процессов, происходящих внутри зоны между 14 и 15 LLR [139]. Интересно, что удаление N-концевого участка рецептора имеет значение только для сигналинга, но не для свя-зывания с лигандом [145]. Процессы рецепторной перестройки для TLR7 и TLR8 аналогичны, что еще раз говорит об их струк-турном сходстве [103, 151].

Как известно, математические методы моделирования явля-ются одним из основных способов прогнозирования структуры рецепторов, а также форм лиганд-рецепторного взаимодействия. Гомологичное моделирование in silico представляется надежным методом предсказания 3D-структуры белка, особенно при отсут-ствии данных рентгеноструктурного анализа и кристаллографии, как в случае с TLR7.

Считается, что корректные данные после выравнивания ами-нокислотных последовательностей для исследуемого белка-ре-цептора могут быть получены, если расхождения в аминокис-лотной последовательности между ним и белком-шаблоном не превышают 30 % [317]. Аминокислотные последовательности TLR7 и TLR8 имеют 72,7 % сходства, а кодирующие их гены идентичны на 42,3 % [4]. На рис. 15 приведена модель димерной формы рецептора TLR7, полученной методом гомологичного моделирования с использованием данных кристаллографии для TLR8 [111].

Рис. 15. Новая модель димера TLR7, полученная с использованием кристаллографической структуры TLR8 в качестве шаблона.

N-конец пептидной цепи выделен красным, С-конец – синим цветом

Рис. 16. Зона связывания для TLR7 [111] (пояснение в тексте)

Рис. 17. Ориентация молекул производных имидазолхинолина внутри связывающего центра TLR7.

Основные взаимодействующие атомы углерода для имихимода выделены желтым цветом. Основные взаимодействующие атомы углерода для резихимода показаны голубым. Взаимодействующие атомы углерода аминокислотных остатков — темно-зеленые. Атомы водорода — синие. Полярные атомы водорода выделены белым цветом. Атомы кислорода — красные. Поверхность рецепторного кармана показана серым цветом. Водородные связи — черные. C-H-π взаимодействие сопряженной системы имихимода и алифатического радикала Leu557 выделено светло-зеленым.

С помощью молекулярного докинга была определена трех-мерная структура связывающего кармана TLR7 ( рис. 16) [117, 317]. Было показано, что зона связывания рецептора расположена вокруг остатков Asp555 и Thp574/586. Гидрофобная зона вы-делена зеленым цветом, полярный участок — фиолетовым, зоны молекулы, обращенные к растворителю, показаны красным, связывающий участок рецептора, используемый для работе в про-грамме Autodock, — светло-зеленым. Консервативные аминокислотные остатки для TLR7 и TLR8 выделены оранжевым цветом для первого мономера и сиреневым — для второго. Консервативные остатки Asp555, Gly584, Thr586, Phe349, Tyr356, Gly379, Val381, and Phe408 образуют связывающую зону (карман) рецептора. Энергия связывания, вычисленная с помощью программы Autodock 4.1. с использованием алгоритма Ламарка, составляет от –6,09 ккал/моль до –8,53 ккал/моль для имихимода и резихимода, соответственно.

Как следует из рис. 17, оба производных имидазолхинолина похожим образом встраиваются в рецепторный карман TLP7 [111]. Видно, что остаток лейцина в положении 557 играет ключевую роль для связывания имихимода и TLR7. Таким образом,

С помощью методов математического моделирования определены структура рецептора имихимода — TLR7, аминокислотная последовательность и трехмерная структура связывающего участка рецептора, а также вычислены энергии связывания между имихимодом и TLR7.

Представленные сведения дают общее представление о структуре связывающего центра TLR7, что в совокупности с метода-ми химического синтеза имихимода и комплекса исследований по созданию лекарственной формы воспроизведенного препарата Вартоцид и его сопоставления с оригинальным кремом Aldara^® дает основание для последующей оценки его биологических и фармакологических свойств.