Главная/Синтез пептидов на заказ/Материалы и Исследования/Влияние пептида LYS-GLU-TRP на межклеточные взаимодействия и пролиферацию эндотелия сосудов в норме и при атеросклерозе
МАТЕРИАЛЫ&ИССЛЕДОВАНИЯ
Влияние пептида LYS-GLU-TRP на межклеточные взаимодействия и пролиферацию эндотелия сосудов в норме и при атеросклерозе
В.В.Малинин, А.О.Дурнова*, В.О.Полякова*, И.М.Кветной*
Медико-биологический научно-производственный комплекс “Цитомед”;
*ФГБУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта СЗО РАМН, Санкт-Петербург
Журнал «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины», 2014. Том 157/№3. – С. 298-300
Скачать PDF
В основе молекулярного механизма развития атеросклероза лежит снижение экспрессии сигнальных молекул коннексина (Сх37, Сх40), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и пролиферативного белка Ki-67, характеризующих процессы межклеточных взаимодействий и пролиферацию эндотелиоцитов сосудов. Пептид Lys-Glu-Trp в концентрациях 4 и 40 мкг/мл способствовал восстановлению экспрессии маркеров Сх37, Сх40, VEGF в культуре эндотелиоцитов аорты, полученной от пациентов с атеросклерозом, что указывает на его вазопротективные свойства.
Одной из наиболее распространенных видов сердечно-сосудистой патологии является атеросклероз, лежащий в основе ИБС и приводящий к тяжелым осложнениям в виде инфаркта миокарда и хронической сердечной недостаточности. Существующие лекарственные препараты зачастую лишь нивелируют симптомы атеросклероза, но не оказывают таргетного фармакологического действия на ключевые звенья патогенеза заболевания. В связи с этим для разработки новых эффективных средств в борьбе с атеросклеротическим поражением сосудов необходимо понимание основ его патогенеза.
Важной проблемой патогенеза атеросклероза является молекулярная характеристика эндотелия сосудов, который активно вовлекается в нарушение метаболизма основного вещества и белков (эластина, коллагена) в сосудистой стенке [5]. Эти изменения могут возникать даже на ранних стадиях атеросклеротического процесса, предшествуя накоплению липидов в стенке артерий. Одними из ключевых сигнальных молекул сосудистой стенки и ее патологии являются кон- нексины (Сх), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и пролиферативный белок Ki-67.
Коннексины представляют собой мембранные белки, образующие канал, осуществляющий молекулярные взаимодействия между клетками. Коннексины являются тканеспецифичными белками: для сердечно-сосудистой системы характерными белками этой группы являются Сх37 и Сх40 [6,7]. С Сх43 взаимодействуют киназы, (3-ка- тенин, дребрин, тубулин, кавеолин-1 и др. Белок дребрин взаимодействует с коннексинами и с микрофиламентами, что указывает на взаимосвязь каналов и организации цитоскелета клетки. Известно, что мутации в генах, кодирующих Сх40, могут лежать в основе сердечно-сосудистой патологии [1]. Показано, что повышенная экспрессия Сх40, сопутствующая операции на сердце, может являться предвестником послеоперационной фибрилляции предсердий [8,9].
Транскрипционный фактор Ki-67 является маркером пролиферативной активности клеток. Пациенты с атеросклерозом аорты и артерий нижних конечностей имеют высокий уровень пролиферативной активности по сравнению с пациентами без атеросклероза [11]. Пролиферативная активность эндотелиальных и гладкомышечных клеток стенки аорты, агрессивность и активность атеросклероза у больных с тромботическими ре- оккпюзиями в отдаленном послеоперационном периоде превышает таковую у больных без тромбозов и способствует наступлению данного осложнения после операции [3].
Другой сигнальной молекулой — маркером развития атеросклероза — является VEGF, который индуцирует пролиферацию клеток эндотелия и сосудистую проницаемость [4,10].
Целью данной работы являлось изучение влияния пептида Lys-Glu-Trp [2] на экспрессию сигнальных молекул — маркеров межклеточных взаимодействий и пролиферативной активности — в клетках эндотелия сосудов пациентов с атеросклерозом.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Материал аорты без патологических изменений был получен от эмбриона человека (21 нед гестации) в НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.От- та РАМН. Ткань атеросклеротической аорты человека (4 фрагмента диаметром 0.2 см) была получена при операции аортокоронарного шунтирования. Материал брали в стерильных условиях и помещали в стерильную емкость с физиологическим раствором.
Путем ферментативной диссоциации (колла- геназа) из материала аорты была получена первичная культура ткани эндотелия. Выделение первичной культуры проводилось на чашках Петри (“Sarstedt”), обработанных раствором фибриногена (“Gibco”); последующее культивирование проводилось во флаконах с обработанной поверхностью объемом 50 мл (25 см2; “Sarstedt”).
Среда для культивирования клеток содержала 87.5% М199, 10% фосфатно-солевого буфера, 1.5% HEPES, 1% PES (phenazine ethosulfate) и L-глутамин. Пассирование клеток проводили через 3 сут на 4-е, посевная концентрация составляла примерно 3×105 клеток на флакон. Культивирование проводили до 3-го пассажа (для эндотелия, пораженного атеросклерозом) и до 7-го пассажа (для нормального эндотелия), на которых клетки рассевали на 24-луночный планшет для иммуноцитохимического окрашивания.
Все культуры (нормального и пораженного атеросклерозом эндотелия) были разделены на 3 группы: 1-я — контроль (без введения пептида), 2-я — с добавлением пептида в концентрации 4 мкг/мл, 3-я — в концентрации 40 мкг/мл.
Для иммуноцитохимического исследования использовали первичные моноклональные антитела к маркерам Сх37 (1:20; “Abgent”), Сх40 (1:100; “Abeam”), VEGF (1:50; “Dako”), Ki-67 (1:50; “Dako”) и вторичные антитела — биотинилированные антимышиные иммуноглобулины. Пер- меабилизацию проводили с применением 0.5% Тритона Х-100. Визуализацию реакции выполняли с применением пероксидазы хрена и диами- нобензидина (“EnVision Detection System”, Pero- xidase/DAB, Rabbit, Mouse). Результаты иммуно- цитохимического окрашивания оценивали морфометрическим методом на микроскопе “Nikon Eclipse” Е400 с помощью цифровой камеры “Nikon” DXM1200 и программного обеспечения “Videotest Morphology 5.2”. В каждом случае анализировали 5 полей зрения при увеличении 200. Площадь экспрессии рассчитывали как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения и выражали в процентах.
Статистическую обработку полученных данных проводили в программе “Statistica 7.0”. Для сравнения и оценки межгрупповых различий использовали непараметрический U критерий Манна—Уитни, который является наиболее точным методом для сравнения выборок, включающих около 10-15 элементов. Различия считали статистически значимыми при р<0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В культурах клеток эндотелия сосудов, полученных от здоровых доноров, экспрессия маркеров VEGF, Сх37, Сх40 и Ki-67 была в 3-25 раз выше по сравнению с соответствующими показателями для эндотелиоцитов, полученных от пациентов с атеросклерозом (таблица).
В культуре клеток эндотелия здоровых доноров исследуемый пептид способствовал достоверному увеличению только одного из исследуемых маркеров — Сх37, и не влиял на экспрессию белков VEGF, Сх40 и Ki-67. Однако пептид оказывал выраженное протективное действие на культуру эндотелиоцитов, полученных от пациентов с атеросклерозом. Так, при атеросклерозе под действием пептида в концентрациях 4 и 40 мкг/мл экспрессия VEGF в клетках сосудов возрастала в 2 и 3 раза соответственно по сравнению с контролем (таблица).
Интересно, что в зависимости от концентрации пептида изменялось его влияние на экспрессию Сх37 и Сх40 в культуре эндотелиоцитов, полученных от больных с атеросклеротическим поражением сосудов. Пептид в концентрации 4 мкг/мл стимулировал повышение экспрессии Сх40 в 2.3 раза по сравнению с контролем, но не влиял на экспрессию Сх37, тогда как в концентрации 40 мкг/мл этот пептид вызывал увеличение экспрессии Сх37 в 1.9 раза по сравнению с контролем, но не влиял на синтез Сх40 (таблица). При этом пептид в обеих исследуемых концентрациях не влиял на экспрессию пролиферативного белка Ki-67 в клетках эндотелия, полученных от пациентов с атеросклерозом (таблица).
Влияние пептида на площадь экспрессии сигнальных молекул эндотелия сосудов в норме и при атеросклерозе.
Примечание. р<0.05 по сравнению *с нормой, *с соответствующим контролем.
Полученные данные свидетельствуют о том, что в основе молекулярного механизма атеросклеротического поражения сосудов лежит снижение экспрессии ряда сигнальных молекул, участвующих в межклеточных взаимодействиях эндотелиоцитов (Сх37 и Сх40), ангио- и васкулогенезе (фактор VEGF) и пролиферации (транскрипционный фактор Ki-67).
Исследуемый пептид, с одной стороны, не влияет на экспрессию сигнальных молекул в нормальном эндотелии, а с другой — способствует значительному повышению сниженной при атеросклерозе экспрессии указанных сигнальных молекул. Таким образом, пептид Lys-Glu-Trp, способствующий восстановлению межклеточных взаимодействий и неоваскулогенезу, является перспективным средством для таргетной терапии атеросклеротического поражения сосудов, ИБС и инфаркта миокарда.
Дополнительная информация о МБНПК Цитомед: клинические исследования препаратов.
Литература:
- ВоеводаМ.И.,КазариноваЮ.Л.,МаксимовВ.Н.идр. // Вести, аритмол. 2011. № 63. С. 32-35.
- Патент РФ № 2458935. Средство для коррекции метаболического синдрома/В.В.Малинин//Бюл. № 23 от 20.08.2012.
- Полянцев А.А., Мозговой П.В., Фролов Д.В., Сни- гур Г.Л. // Биомед. журн. 2011. Т. 12. С. 410-419.
- Сергиенко И.В., Семенова А.Б., Масенко В.П.идр.// Кардиология. 2007. Т. 47, № 8. С. 4-7.
- Торшин И.Ю., Громова О.А. // Трудный пациент.
- Т. 6, № 4. С. 5-11.
- Berliner J.A., Navab М., Fogelman A.M. et al. // 1995. Vol. 91, N 9. P. 2488-2496.
- Coppen S.R., Dupont E„ Rotkery S., Severs N.J. // Res. 1998. Vol. 82, N 2. P. 232-243.
- Dupont E„ Ко Y„ RotheryS. et al. // 2001. Vol. 103, N 6. P. 842-849.
- , O’Hara G„ PhilipponF. etal. //Eur. Heart J. 2001. Vol. 22, N 16. P. 1511-1512.
- Lieb W„ Safa R„ Benjamin E.J. et al. // Heart J.
- 30, N 9. P. 1121-1127.
- Shayanfar N., Mashayekh M„ Mohammadpour M. // Acta Med. Iran. 2010. Vol. 48, N 3. P. 142-147
Скачать PDF
Назад к списку