Влияние пептида LYS-GLU-TRP на межклеточные взаимодействия и пролиферацию эндотелия сосудов в норме и при атеросклерозе

В основе молекулярного механизма развития атеросклероза лежит снижение экспрес­сии сигнальных молекул коннексина (Сх37, Сх40), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и пролиферативного белка Ki-67, характеризующих процессы межклеточных взаимодействий и пролиферацию эндотелиоцитов сосудов. Пептид Lys-Glu-Trp в кон­центрациях 4 и 40 мкг/мл способствовал восстановлению экспрессии маркеров Сх37, Сх40, VEGF в культуре эндотелиоцитов аорты, полученной от пациентов с атероскле­розом, что указывает на его вазопротективные свойства.

Одной из наиболее распространенных видов сер­дечно-сосудистой патологии является атероскле­роз, лежащий в основе ИБС и приводящий к тя­желым осложнениям в виде инфаркта миокарда и хронической сердечной недостаточности. Су­ществующие лекарственные препараты зачас­тую лишь нивелируют симптомы атеросклероза, но не оказывают таргетного фармакологического действия на ключевые звенья патогенеза забо­левания. В связи с этим для разработки новых эффективных средств в борьбе с атеросклеро­тическим поражением сосудов необходимо пони­мание основ его патогенеза.

Важной проблемой патогенеза атеросклеро­за является молекулярная характеристика эндо­телия сосудов, который активно вовлекается в нарушение метаболизма основного вещества и белков (эластина, коллагена) в сосудистой стен­ке [5]. Эти изменения могут возникать даже на ранних стадиях атеросклеротического процесса, предшествуя накоплению липидов в стенке ар­терий. Одними из ключевых сигнальных молекул сосудистой стенки и ее патологии являются кон- нексины (Сх), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и пролиферативный белок Ki-67.

Коннексины представляют собой мембран­ные белки, образующие канал, осуществляющий молекулярные взаимодействия между клетками. Коннексины являются тканеспецифичными бел­ками: для сердечно-сосудистой системы харак­терными белками этой группы являются Сх37 и Сх40 [6,7]. С Сх43 взаимодействуют киназы, (3-ка- тенин, дребрин, тубулин, кавеолин-1 и др. Белок дребрин взаимодействует с коннексинами и с микрофиламентами, что указывает на взаимо­связь каналов и организации цитоскелета клет­ки. Известно, что мутации в генах, кодирующих Сх40, могут лежать в основе сердечно-сосудис­той патологии [1]. Показано, что повышенная экс­прессия Сх40, сопутствующая операции на серд­це, может являться предвестником послеопера­ционной фибрилляции предсердий [8,9].

Транскрипционный фактор Ki-67 является маркером пролиферативной активности клеток. Пациенты с атеросклерозом аорты и артерий ниж­них конечностей имеют высокий уровень проли­феративной активности по сравнению с пациен­тами без атеросклероза [11]. Пролиферативная активность эндотелиальных и гладкомышечных клеток стенки аорты, агрессивность и активность атеросклероза у больных с тромботическими ре- оккпюзиями в отдаленном послеоперационном периоде превышает таковую у больных без тром­бозов и способствует наступлению данного ослож­нения после операции [3].

Другой сигнальной молекулой — маркером развития атеросклероза — является VEGF, ко­торый индуцирует пролиферацию клеток эндоте­лия и сосудистую проницаемость [4,10].

Целью данной работы являлось изучение влия­ния пептида Lys-Glu-Trp [2] на экспрессию сигналь­ных молекул — маркеров межклеточных взаи­модействий и пролиферативной активности — в клетках эндотелия сосудов пациентов с атеро­склерозом.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал аорты без патологических изменений был получен от эмбриона человека (21 нед геста­ции) в НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.От- та РАМН. Ткань атеросклеротической аорты че­ловека (4 фрагмента диаметром 0.2 см) была по­лучена при операции аортокоронарного шунти­рования. Материал брали в стерильных условиях и помещали в стерильную емкость с физиоло­гическим раствором.

Путем ферментативной диссоциации (колла- геназа) из материала аорты была получена пер­вичная культура ткани эндотелия. Выделение пер­вичной культуры проводилось на чашках Петри (“Sarstedt”), обработанных раствором фибриноге­на (“Gibco”); последующее культивирование про­водилось во флаконах с обработанной поверх­ностью объемом 50 мл (25 см²; “Sarstedt”).

Среда для культивирования клеток содержа­ла 87.5% М199, 10% фосфатно-солевого буфе­ра, 1.5% HEPES, 1% PES (phenazine ethosulfate) и L-глутамин. Пассирование клеток проводили через 3 сут на 4-е, посевная концентрация состав­ляла примерно 3×10⁵ клеток на флакон. Культи­вирование проводили до 3-го пассажа (для эндо­телия, пораженного атеросклерозом) и до 7-го пассажа (для нормального эндотелия), на кото­рых клетки рассевали на 24-луночный планшет для иммуноцитохимического окрашивания.

Все культуры (нормального и пораженного атеросклерозом эндотелия) были разделены на 3 группы: 1-я — контроль (без введения пепти­да), 2-я — с добавлением пептида в концентра­ции 4 мкг/мл, 3-я — в концентрации 40 мкг/мл.

Для иммуноцитохимического исследования использовали первичные моноклональные ан­титела к маркерам Сх37 (1:20; “Abgent”), Сх40 (1:100; “Abeam”), VEGF (1:50; “Dako”), Ki-67 (1:50; “Dako”) и вторичные антитела — биотинилиро­ванные антимышиные иммуноглобулины. Пер- меабилизацию проводили с применением 0.5% Тритона Х-100. Визуализацию реакции выполня­ли с применением пероксидазы хрена и диами- нобензидина (“EnVision Detection System”, Pero- xidase/DAB, Rabbit, Mouse). Результаты иммуно- цитохимического окрашивания оценивали мор­фометрическим методом на микроскопе “Nikon Eclipse” Е400 с помощью цифровой камеры “Nikon” DXM1200 и программного обеспечения “Videotest Morphology 5.2”. В каждом случае анализировали 5 полей зрения при увеличении 200. Площадь экспрессии рассчитывали как отношение площа­ди, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения и выра­жали в процентах.

Статистическую обработку полученных дан­ных проводили в программе “Statistica 7.0”. Для сравнения и оценки межгрупповых различий ис­пользовали непараметрический U критерий Ман­на—Уитни, который является наиболее точным методом для сравнения выборок, включающих около 10-15 элементов. Различия считали ста­тистически значимыми при р<0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В культурах клеток эндотелия сосудов, получен­ных от здоровых доноров, экспрессия маркеров VEGF, Сх37, Сх40 и Ki-67 была в 3-25 раз выше по сравнению с соответствующими показателями для эндотелиоцитов, полученных от пациентов с атеросклерозом (таблица).

В культуре клеток эндотелия здоровых доно­ров исследуемый пептид способствовал досто­верному увеличению только одного из исследуе­мых маркеров — Сх37, и не влиял на экспрессию белков VEGF, Сх40 и Ki-67. Однако пептид оказы­вал выраженное протективное действие на куль­туру эндотелиоцитов, полученных от пациентов с атеросклерозом. Так, при атеросклерозе под действием пептида в концентрациях 4 и 40 мкг/мл экспрессия VEGF в клетках сосудов возрастала в 2 и 3 раза соответственно по сравнению с конт­ролем (таблица).

Интересно, что в зависимости от концентра­ции пептида изменялось его влияние на экспрес­сию Сх37 и Сх40 в культуре эндотелиоцитов, полу­ченных от больных с атеросклеротическим пора­жением сосудов. Пептид в концентрации 4 мкг/мл стимулировал повышение экспрессии Сх40 в 2.3 раза по сравнению с контролем, но не влиял на экспрессию Сх37, тогда как в концентрации 40 мкг/мл этот пептид вызывал увеличение экс­прессии Сх37 в 1.9 раза по сравнению с контро­лем, но не влиял на синтез Сх40 (таблица). При этом пептид в обеих исследуемых концентрациях не влиял на экспрессию пролиферативного бел­ка Ki-67 в клетках эндотелия, полученных от па­циентов с атеросклерозом (таблица).

Влияние пептида на площадь экспрессии сигнальных молекул эндотелия сосудов в норме и при атеросклерозе.

Примечание. р<0.05 по сравнению *с нормой, *с соответствующим контролем.

Полученные данные свидетельствуют о том, что в основе молекулярного механизма атероскле­ротического поражения сосудов лежит снижение экспрессии ряда сигнальных молекул, участвую­щих в межклеточных взаимодействиях эндотелиоцитов (Сх37 и Сх40), ангио- и васкулогенезе (фактор VEGF) и пролиферации (транскрипцион­ный фактор Ki-67).

Исследуемый пептид, с одной стороны, не влияет на экспрессию сигнальных молекул в нор­мальном эндотелии, а с другой — способствует значительному повышению сниженной при ате­росклерозе экспрессии указанных сигнальных молекул. Таким образом, пептид Lys-Glu-Trp, способствующий восстановлению межклеточных взаимодействий и неоваскулогенезу, является перспективным средством для таргетной тера­пии атеросклеротического поражения сосудов, ИБС и инфаркта миокарда.
Дополнительная информация о МБНПК Цитомед: клинические исследования препаратов.

Литература: