Воздействие на клеточные мишени как средство борьбы с гриппозной инфекцией

Резюме. Грипп представляет собой высоко контагиозное заболевание человека. На фоне использования про­тивовирусных препаратов формируются лекарственно-устойчивые штаммы вируса, следствием чего являет­ся снижение эффективности этиотропной химиотерапии. В обзоре рассмотрены способы снижения уровня репликации вируса и тяжести патологического процесса, основанные на использовании альтернативных мишеней не вирусного, а клеточного происхождения. Описаны препараты, снижающие продукцию провос­палительных цитокинов (эриторан), ограничивающие дегрануляцию тучных клеток (кетотифен), ингибито­ры циклооксигеназ (целекоксиб, месалазин, SC-560), ингибиторы сфингозин-1-фосфатного пути (AAL-R), а также повышающие стабильность сосудов путем упрочения контактов между эндотелиальными клетками (белок Slit). Особое внимание уделено ингибиторам клеточных путей, используемых вирусом для повышения репродукции, таких как NF-kB, Raf/MEK/ERK, PI3K/AKT/mTOR. Описана противогриппозная активность ингибиторов киназ и процесса аутофагии, а также препаратов смешанного механизма действия — глицирри- зиновой кислоты и дипептида а-глутамилтриптофана. Дальнейшие исследования в области поиска и опти­мизации ингибиторов клеточных компонентов как средств против гриппозной инфекции могут привести к разработке новых противовирусных препаратов высокой эффективности, широкого спектра действия и низкой вероятности развития резистентности.

Грипп представляет собой высококонтагиоз­ное заболевание человека. Ежегодно гриппом на планете переболевает 500 млн человек, уми­рает около 2 млн [23]. Вирус гриппа вызывает ежегодные эпидемии, а при появлении нового антигенного варианта вируса — пандемии, охва­тывающие все регионы земного шара и характе­ризующиеся высокой заболеваемостью, числом пациентов, нуждающихся в госпитализации и смертностью среди всех возрастных групп на­селения. Пандемия гриппа А(H1N1)pdm09 ха­рактеризовалась широким охватом населения многих стран мира, в том числе Российской Фе­дерации, тяжелым клиническим течением и вы­сокой летальностью [5, 16]. Неблагоприятные исходы чаще всего наблюдались не только у лиц с сопутствующими хроническими заболевания­ми [16], но и у молодых людей без существенной предшествующей патологии, в том числе у бе­ременных женщин [3, 4]. В последние годы от­мечены также случаи инфицирования человека вирусами гриппа птичьего происхождения под­типов H5N1, H7N7 и H7N9 [39].

Вирионы гриппа представляют собой сфе­рические или нитевидные частицы диаметром 80—100 нм, покрытые липидной оболочкой с ин­тегрированными поверхностными гликопро­теидами трех типов — гемагглютинином (HA) и нейраминидазой (NA) и вирусным ионным каналом М2. Оболочка вириона происходит от плазматической мембраны клетки-хозяина и содержит липидные «плотики» — участки ли­пидного бислоя, обогащенные холестерином и имеющие высокую плотность и меньшую те­кучесть, отделенные друг от друга текучими участками мембраны малой плотности. Под ли­пидной оболочкой расположен слой матриксно­го белка M1, контактирующего с одной стороны с цитоплазматическими доменами HA и NA, а с другой — с сердцевиной вириона. Сердце­винный рибонуклеопротеин (РНП) представлен восемью сегментами генома — одноцепочечной РНК негативной полярности — в комплексе с белком нуклеопротеина и тремя субъединица­ми полимеразного комплекса.

При инфицировании клетки РНП попада­ют в цитоплазму и ядро, где происходит транс­крипция, трансляция и репликация сегментов вирусного генома. Транскрипция и репликация вирусспецифических РНК осуществляются ви­русным полимеразным комплексом. В отличие от полимераз эукариотических клеток, вирусная полимераза лишена механизма коррекции оши­бок. Вследствие этого частота мутаций вирусно­го генома составляет, по разным оценкам, от 10^-4 до 10^-6 нуклеотидов на цикл репликации [44, 54]. Это на несколько порядков выше, чем скорость мутирования бактерий и эукариот (10^-10—10^-11) [10]. Вследствие этих особенностей, а также ко­роткого жизненного цикла эволюция вируса гриппа протекает быстро. Это служит причи­ной двух явлений. Во-первых, быстрое фор­мирование мутаций позволяет вирусу ускольз­ать от адаптивного иммунного ответа хозяина. Благодаря этому он способен вызывать ежегод­ные эпидемии, несмотря на формирование им­мунной прослойки населения как следствие вакцинации и естественной заболеваемости. Во-вторых, на фоне использования противови­русных препаратов формируются лекарственно­устойчивые штаммы вируса, следствием чего является снижение эффективности противовирусной химиотерапии.

В настоящее время для профилактики и те­рапии гриппозной инфекции доступны пре­параты, обладающие различным механизмом активности. Следуя последовательности собы­тий при развитии гриппозной инфекции, к ним необходимо отнести, во-первых, препараты ин- терферонов и их индукторов, стимулирующие врожденный иммунитет и ограничивающие инфекцию на ранних стадиях [55], и во-вто­рых, этиотропные препараты, воздействующие на специфические вирусные мишени. Между­народно признанными противогриппозными препаратами являются химические соедине­ния двух групп — производные адамантана (амантадин и его аналог в России — реманта­дин) [49] и ингибиторы вирусной нейрамини- дазы — осельтамивир (Тамифлю®) и занамивир (Реленца®) [8]. В США получено разрешение FDA на использование еще двух ингибиторов нейраминидазы — перамивира (Рапиакта®) внутривенно [50], и ланинамивира (Инавир®) ингаляционно [58]. В России ни перамивир, ни ланинамивир не сертифицированы. Смотрите также публикацию: о роли иммуномодуляторов в лечении и профилактике ГРИППА и ОРВИ.

Недостатком препаратов как первой, так и второй группы является снижение их эф­фективности при позднем начале лечения [29]. Препараты интерферонов и их индукторов про­являют максимальный уровень защиты при использовании в качестве средств экстренной профилактики, проводимой сразу после инфицирования, еще до появления клинических симптомов. Этиотропные средства эффектив­ны в первые 48 ч после появления клинических симптомов болезни [29]. Кроме того, к этиотроп­ным препаратам вирус, как уже упоминалось, способен быстро вырабатывать устойчивость. С середины 90-х гг., например, отмечен рост доли ремантадин-устойчивых вирусов, и на сегод­няшний день практически все изоляты вируса гриппа устойчивы к препаратам адамантаново- го ряда — амантадину и ремантадину [19]. То же было отмечено в пределах подтипа сезонного гриппа A(H1N1), когда за полтора года (с ноя­бря 2007 по март 2009 г.) уровень устойчивости к осельтамивиру вырос с 0 до 100% во всех регио­нах земного шара [9]. Осельтамивир-устойчивые штаммы отмечены также среди изолятов высо­копатогенных вирусов гриппа птиц H5N1 [19] и H7N9 [22], а кроме того, описаны случаи фор­мирования лекарственно-устойчивых вариан­тов вируса непосредственно в процессе терапии пациентов [22].

Когда речь идет о случаях тяжелого, затяжно­го, осложненного гриппа, включающих послед­ствия цитокинового шторма [56], или поздних стадий болезни, для уменьшения тяжести забо­левания применяют препараты третьей группы, снижающие остроту реактивных процессов. Та­кие процессы индуцируются вирусом, но реа­лизуются механизмами хозяина. К ним следует отнести такие явления, как отек легких, токси­ческий синдром, гиперпродукцию провоспали­тельных цитокинов, клеточную воспалительную инфильтрацию ткани легких, геморрагический синдром и т.п. Препараты этой группы не влия­ют на вирусную репродукцию, а представляют собой средства, влияющие на другие факторы патогенеза гриппозной инфекции, то есть сред­ства патогенетической терапии.

Эти соединения являются важной состав­ляющей терапии не только гриппа, но и других заболеваний со сходным патогенезом. Так, на­пример, в качестве средства борьбы с экспресси­ей провоспалительных цитокинов при сепсисе был разработан антагонист TLR4 эриторан [42]. Помимо сепсиса, однако, он оказался эффектив­ным средством защиты и от летальной гриппоз­ной инфекции [52]. При дозе вируса, вызываю­щей гибель 90% животных в контроле, в группе, получавшей эриторан со 2 суток после инфици­рования, гибель составила лишь 10—20%, что обеспечивало индекс защшы 78—89%, сопоста­вимый с показателями препарата сравнения — этиотропного средства осельтамивира. Более того, эриторан проявлял протективную актив­ность и на поздних стадиях инфекции, вплоть до 6-х суток после заражения, когда активность осельтамивира уже не отмечалась [52]. Использо­вание эриторана приводило также к значитель­ной нормализации морфологической картины легких, снижая степень отека и воспалитель­ной инфильтрации легочной ткани. При этом инфекционная активность вируса не менялась под воздействием препарата за исключением поздних стадий развития инфекции, когда раз­множение вируса в ткани уже не играет ведущей патогенетической роли.

Тяжесть гриппа, как уже упоминалось, во мно­гом обусловлена дисрегуляцией воспалительного ответа на заражение вирусом. Такая инфекция характеризуется избыточной степенью воспали­тельных процессов и гиперпродукцией провос­палительных цитокинов, известной как «цито- киновый шторм» [56]. Одним из ведущих путей развития воспаления является каскад реакций, запускаемый ферментами циклооксигеназами COX-1 и COX-2, катализирующими превращение арахидоновой кислоты в простагландины. Инги­биторы циклооксигеназ широко используются в медицине как анальгетики и противовоспали­тельные средства. Классические нестероидные противовоспалительные препараты блокируют как COX-1, так и COX-2, предпочтительнее все же COX-1. В эксперименте синтетические ин­гибиторы COX-2 (целекоксиб) и COX-1 (SC-560) оказались способны в значительной мере сни­зить продукцию провоспалительных цитокинов TNFa и G-CSF в бронхолегочных смывах мышей при гриппозной инфекции [6], однако сколько- нибудь существенного влияния на смертность животных, а тем более на продукцию вируса в легких обнаружено не было. Больше того, из­бирательное угнетение COX-1 приводило даже к повышению смертности, потере веса животны­ми и более выраженной гипотермии, возможно играющей в данном случае ключевую роль.

В другом исследовании [62] была показана дополнительная протективная активность ком­бинации двух ингибиторов оксигеназ — целе- коксиба и месалазина — с противогриппозным препаратом прямого действия занамивиром. Целекоксиб, как уже указывалось, ингибирует фермент COX-2, месалазин способен угнетать как циклооксигеназный, так и липоксигеназ- ный воспалительные пути, приводя к сниже­нию продукции провоспалительных цитокинов и эйкозаноидов, и, как следствие, к деактивации воспалительных клеток, таких как макрофаги и нейтрофилы. Кроме того, месалазин ингиби­рует активацию фактора NF-kB и стимулирует синтез фосфатидной кислоты, угнетая тем са­мым стимуляцию апоптоза церамидами [62]. При начале лечения через 48 часов после инфи­цирования, что моделирует реальную ситуацию в клинической практике, смертность в группе животных, получавших комбинированное ле­чение, была ниже, чем в группе, получавшей за- намивир в виде монопрепарата. Снижение титра вируса в легких при этом сопровождалось нор­мализацией структуры легочной ткани и сниже­нием степени ее воспалительной инфильтрации, в отличие от группы занамивира, где на фоне снижения инфекционной активности вируса не отмечалось разницы в смертности животных и воспалительной реакции в легких.

Другой противовоспалительный препарат — кетотифен — ингибирует процессы деграну­ляции тучных клеток [26]. Этим достигается ограничение продукции в очаге воспаления про­воспалительных медиаторов, включая гистамин, IFNy и фермент триптазу. Эти свойства кетоти- фена обуславливают его высокую протективную активность на модели летальной гриппозной ин­фекции, вызванной высокопатогенным вирусом гриппа подтипа H5N1 [24]. Не влияя собственно на репродукцию вируса в легких, кетотифен, тем не менее, нормализовал показатели веса живот­ных, снижал степень отека и воспалительной инфильтрации легочной ткани, уровень апопто- тических процессов в легких и специфическую смертность животных. При этом активность кетотифена, как и в случае эриторана, превыша­ла активность вирусспецифического препарата осельтамивира [24].

Таким образом, приведенные данные свиде­тельствуют, что необходимы дополнительные экспериментальные и/или клинические иссле­дования, чтобы достоверно обосновать и стан­дартизировать применение ингибиторов цикло­оксигеназ в терапии тяжелого гриппа [25].

Важную роль в развитии воспаления в ор­ганизме играет система реакций сфингозин- 1-фосфатного пути (S1P). Компоненты этого каскада играют важную роль в самых разных аспектах клеточного сигналинга и метаболиз­ма. О важности этого пути свидетельствует, на­пример, тот факт, что стимуляция синтеза S1P приводит к активации факторов транскрипции NF-kB и STAT3 с последующим формировани­ем сигнальной петли, ведущей к злокачестве- ному перерождению клетки. Ингибирование этого процесса фармакологическими препара­тами замедляет рост и прогрессирование опу­холи и уровень воспалительных медиаторов. На 2013 г. описано свыше 25 препаратов, влия­ющих на компоненты S1 P-сигнального пути, из них 11 находятся на завершающих стадиях клинических испытаний или разрешены к при­менению как средства терапии опухолей, рев­матоидного артрита, язвенного колита, рассе­янного склероза, псориаза, то есть патологий, так или иначе основанных на избыточном или неадекватном воспалении [31]. Рецепторы S1P (S1PR1—S1PR5) участвуют в развитии сепсиса, изменении проницаемости сосудов и развитии отека легких. При этом именно последнее ка­сается темы настоящего обзора и обосновывает правомочность регуляции этих компонентов при тяжелом гриппе, признаком которого явля­ется как раз отек легких.

Действительно, применение агониста S1P AAL-R (рис. 1), направленного против раннего иммунного ответа, приводило к существенному снижению смертности животных в эксперимен­те [59], причем степень защиты (82%) превосхо­дила соответствующий показатель для препара­та сравнения — осельтамивира (50%).

Рисунок 1. Структура агониста сфингозин-1- фосфатного пути AAL-R

Подобно кетотифену, AAL-R не влиял на ре­продукцию вируса в легких животных, однако в значительной степени снижал количество кле­ток, составляющих воспалительный экссудат. Способность к продукции противовирусных антител при этом сохранялась. Оптимальные защитные показатели были достигнуты при со­вместном применении осельтамивира и AAL-R. Важно также, что использование этого сфин- гозинового аналога оказалось эффективным даже спустя 4 суток после начала инфекции, что свидетельствует о высоком терапевтическом по­тенциале такого подхода при терапии поздних и осложненных форм гриппа [36].

Отдельного внимания заслуживает еще один подход к терапии тяжелого гриппа — повыше­ние способности организма к преодолению па­тологического процесса путем минимизации вредного действия воспалительных медиаторов на сосуды. Известно, что характерным свойством гриппа является резкое повышение проницае­мости гистогематического барьера, что ведет к развитию множественных геморрагий и обу­словливает полиорганную недостаточность при тяжелом гриппе [28]. Для компенсации этой по­вышенной проницаемости сосудов в организме существуют сигнальные пути противоположной направленности, стабилизирующие состояние эндотелия и базальных мембран. Так, например, последовательность реакций, запускаемая бел­ком Slit и опосредуемая эндотелиальным рецеп­тором Robo4, была идентифицирована как путь, модулирующий стабильность сосудов путем упрочения контактов между эндотелиальны­ми клетками. Активация такого пути оказалась эффективной для снижения проницаемости ка­пилляров, мультиорганного отека и смертности при многих формах экспериментальных инфек­ций, включая высокопатогенный грипп H5N1 [32]. При этом сам белок Slit не влиял на продук­цию вируса. Более того, что особенно важно, он не оказывал воздействия даже на уровень про­воспалительных цитокинов в легких, что сви­детельствует о том, что самого по себе ограни­чения реакции сосудов на гиперцитокинемию достаточно для снижения тяжести заболевания и уровня смертности. В описанных опытах, на­пример, было достигнуто снижение смертности на 40—50%.

В целом, перечисленные препараты приме­няются как патогенетические средства для те­рапии тяжелого гриппа. Отличительная их осо­бенность — высокий терапевтический эффект на поздних сроках заболевания и в случаях тяже­лого и осложненного гриппа — основана на кон­кретных мишенях их действия и особенностях патогенеза таких форм инфекции. Известно, что с точки зрения патогенеза любой инфекци­онный процесс является суммой действия соб­ственно патогена и ответной реакции организма. Как уже упоминалось, препараты прямого про­тивовирусного действия активны лишь в первые дни заболевания, когда в организме протекают интенсивные процессы вирусной репродукции. Однако при уже запущенных реактивных про­цессах — цитокиновом шторме и массовой де­струкции клеток, сформированном отеке легких и нарушениях микроциркуляции органов — основной вклад в патогенез гриппа вносит уже не вирусный, а именно реактивный компонент. Поэтому естественно, что препараты, направ­ленные против этих факторов патогенеза имеют терапевтическую активность.

Выделяется, однако, еще одна, четвертая группа химических препаратов, которая заслу­живает отдельного упоминания. Так же, как и препараты предыдущей группы, эти соеди­нения воздействуют не на вирусные, а на кле­точные мишени. Особенность этих мишеней состоит в том, что выполняя функции, важные для клетки, они являются необходимыми для жизненного цикла самого вируса. Емкость ви­русного генома очень ограничена, и в ходе ре­продукции он вынужден использовать многие клеточные компоненты, в том числе метаболиче­ские и сигнальные механизмы клетки-хозяина. Естественно, что их ингибирование снижает инфекционную активность вируса и уровень его репликации.

Чтобы пояснить зависимость вирусной ре­продукции от клеточных метаболических путей, приведем наиболее очевидный пример — транс­ляция вирусных мРНК, полностью обеспечи­ваемая клеточной системой белкового синтеза. Угнетение этого процесса закономерно приво­дит к резкому снижению вирусной репродукции. Этот путь используется клеткой, например, в ходе развития антивирусного статуса при воздействии на клетки интерферона [46]. Однако селектив­ность такого воздействия невелика, и действие интерферонов затрагивает как вирусные, так и клеточные процессы. В клетке, находящейся в антивирусном статусе, в равной степени разру­шены и вирусные, и клеточные мРНК, благодаря чему подавлен синтез как вирусных, так и кле­точных белков.

C развитием методических подходов к из­учению внутри- и межклеточных механизмов передачи сигнала было выяснено, что многие вирусы способны использовать для собствен­ной репликации и другие метаболические и сиг­нальные клеточные сети [47]. В результате мно­гочисленных исследований были разработаны специфические ингибиторы каждого из них, а за последние несколько лет была обнаружена и охарактеризована их противогриппозная ак­тивность. Приведем наиболее изученные в этом отношении примеры.

При инфицировании клетки вирусом гриппа активируется центральный и наиболее изучен­ный путь регуляции врожденного противови­русного иммунитета — сигнальный путь NF-kB. В клетках он контролирует экспрессию генов, регулирующих острый воспалительный от­вет, адгезию и дифференцировку клеток, апоп­тоз и ответ на вирусную инфекцию. На ранних стадиях инфекция приводит к активации ком­плекса PI3K/Akt и последующей активации экс­прессии NF-kB. Он, в свою очередь, регулирует экспрессию многих генов, включая, в том числе, проапоптотические факторы TRAIL, Fas и FasL. Два последних активируют эффекторные белки апоптоза — каспазы, ферменты, осуществляю­щие специфическую деградацию комплекса ядерных пор в инфицированной клетке [12, 13, 51, 63]. Такая деградация является одним из пер­вых этапов многоступенчатого процесса про­граммируемой клеточной гибели. При помощи этого механизма ценой гибели инфицированной клетки достигается ограничение размножения вируса во всем организме.

Однако следует учитывать, что в ядре зара­женной клетки происходят процессы транскрип­ции и репликации вирусного генома, и присут­ствуют многочисленные фрагменты вирусных РНП, которым предстоит выйти через ядерные поры в цитоплазму для участия в сборке вирио- нов потомства. На последней стадии описанного каскада реакций — деградации ядерных пор бла­годаря активности каспаз — диффузия вирусных РНП через разрушенные поры существенно об­легчается по сравнению с порами интактными. Таким образом, являясь исходно противовирус­ным сигнальным путем, призванным ограничи­вать вирусную репродукцию, NF-kB в опреде­ленный момент, напротив, способствует более активной реализации жизненного цикла вируса [38]. Угнетение этого сигнального пути мешает реализации вирусной программы репликации и снижает эффективность продукции вирионов потомства.

Препараты-ингибиторы этого пути принад­лежат к различным химическим группам и воз­действуют на различные компоненты каскада [18]. Одни из них (SC75741) нарушают связыва­ние NF-kB с ДНК, препятствуя тем самым ин­дукции факторов апоптоза и активации кас- паз, другие (PS-341 (бортезомиб), MG132, VL-01 и др.) являются ингибиторами протеосом, пре­пятствуя убиквитин-зависимой деградации IkB или ингибируют NF-KB-активирующую киназу IKK (ацетилсалициловая кислота, LASAG), что в дальнейшем приводит к угнетению процесса фосфорилирования и деградации IkB. В целом, независимо от конкретной точки приложения, ингибирование тех или иных компонентов пути NF-kB приводит к снижению вирусной продук­ции в клетке [17].

Другим примером использования клеточ­ных путей вирусом гриппа является сигнальный путь Raf/MEK/ERK [33]. Как известно, транс­ляция вирусных белков происходит в цитоплаз­ме инфицированной клетки. Синтезированные поверхностные белки вириона — мембранный белок M1, гемагглютинин (HA) и нейраминида- за (NA) — транспортируются к плазматической мембране, встраиваются в нее и формируют кла­стеры. РНП потомства транспортируются к сай­там скоплений поверхностных белков, взаимо­действуют с белком М1 и цитоплазматическими доменами HA и NA, что приводит к искривле­нию мембраны и дальнейшему почкованию ви- рионов потомства [48].

Формирование вирусных РНП происходит в ядре инфицированной клетки. С одной сто­роны, для полноценного формирования им не­обходимо находиться в ядре достаточно долго, чтобы образовать полноценную сердцевину бу­дущих вирионов. С другой стороны, к моменту образования кластеров HA и NA на плазмати­ческой мембране им необходимо транспортиро­ваться к сайтам сборки и почкования вирионов, то есть должен существовать механизм, запус­кающий или подавляющий ядерный экспорт РНП в зависимости от стадии развития инфек­ционного процесса в клетке. Таким механизмом и является сигнальный путь Raf/MEK/ERK. Его активация индуцируется сборкой агломератов вирусных гликопротеидов на поверхности клет­ки, и его компоненты направляют транспорт РНП к плазматической мембране. На сегодняш­ний день неясно, каким именно образом это происходит. Однако ингибиторы этого сигналь­ного пути в значительной степени препятствуют нормальному протеканию вирусной инфекции и накоплению вируса в высоких титрах [35, 45].

Одним из первых этапов пути Raf/MEK/ ERK, является активация белка Raf при помо­щи ГТФ-связанной формы белка Ras. Посколь­ку примерно половина новообразований чело­века содержит в клетках мутации в генах raf или ras, разработка ингибиторов этих генов ве­лась исключительно в аспекте онкологических проблем. Так, шесть препаратов, доведенных до II фазы клинических исследований в обла­сти противораковой химиотерапии, оказались эффективными ингибиторами гриппозной ин­фекции. Это соединения, близкие между собой по химической структуре — U0126, препараты CI-1040 и PD-0325901, AZD-6244 и AZD-8330, а также препарат RDEA-119 (рис. 2). Их 50% ин­гибирующие концентрации в отношении виру­са гриппа лежат в пределах от 1200 до 4 нМ, что свидетельствует об их высокой противовирус­ной активности [11, 20].

Рисунок 2. Ингибиторы сигнального пути Raf/MEK/ERK, доведенные до стадии клинических исследований

Еще один сигнальный путь — PI3K/AKT/ mTOR — также используется вирусом гриппа для обеспечения собственной репликации [12]. В клетке этот путь регулирует дифференци- ровку, метаболизм и инициацию трансляции, а также во многом пересекается с другими сиг­нальными путями, такими как Raf/MEK/ERK и NF-kB. В ходе вирусной репродукции этот путь используется на ранних этапах вирусной инфекции — для регуляции проникновения вируса в клетку, а также на поздних стадиях — для правильной локализации вирусных РНП и предотвращения преждевременного апопто­за инфицированных клеток. Бактериальный метаболит вортманнин и морфолиновое производное кверцетина LY294002, хотя и не были доведены до стадии клинических исследова­ний из-за низкой биодоступности, явились, тем не менее, важным инструментом для фундамен­тальных исследований, связанных с передачей сигнала посредством PDK-пути, а также осно­вой для разработки оптимизированных произ­водных [34]. Одно из них, NVP-BEZ235 (рис. 3), проходит II фазу клинических исследований в качестве противоракового препарата [47].

Рисунок 3. Структура NVP-BEZ235 — ингибитора PI3K/AKT/mTOR [47]

Описан еще один сигнальный путь, связан­ный с гриппозной инфекцией. Инфицирова­ние вирусом гриппа активирует сигнальный белок C-Jun терминальную киназу (JNK). Она, в свою очередь, активирует фактор транскрип­ции AP-1, который стимулирует экспрессию интерферона-в, играющего важную роль в про­тивовирусном ответе клетки. Ингибирование JNK, следовательно, должно приводить к по­вышению вирусной продукции. Тем не менее, синтетические ингибиторы SP600125 и AS601245 (рис. 4), напротив, снижали уровень репродук­ции вирусов гриппа независимо от их подтипа. Противовирусная активность этих препаратов была обусловлена их способностью ингибиро­вать синтез вирусных РНК при помощи не вы­ясненного пока механизма [43]. Известно также, что SP600125 не влияет напрямую на активность вирусной РНК-полимеразы, а подавляет актив­ность вирусного белка NS1, что, по-видимому, приводит к большей эффективности системы противовирусного врожденного иммунитета. Эти результаты были подтверждены в опытах на животных, где SP600125 снижал вирусную нагрузку в легких мышей по сравнению с конт­рольной группой.

Рисунок 4. Структуры SP600125 (а) и AS601245 (б) [43]

В работе Kumar et al. [30] были идентифициро­ваны два ингибитора тирозинкиназных рецепто­ров, также проявляющих выраженную противо­гриппозную активность. Один из них, AG879, является селективным ингибитором сигналь­ного пути, обусловленного рецептором фактора роста нервов и рецептором эпидермального фак­тора роста 2 (TrkA/HER2), другой — тирфостин А9 — ингибирует сигнальный путь фактора роста тромбоцитов (PDGFR). Каждый из этих ингиби­торов угнетает по крайней мере три внутрикле­точных стадии жизненного цикла вируса — оба ингибируют синтез всех трех типов вирусспе­цифических РНК, блокируют ядерный экспорт вирусных РНП, а также предотвращают почко­вание дочерних вирусных частиц, воздействуя на путь, направляемый ферментом биосинтеза липидов — фарнезилдифосфатсинтетазой.

Говоря о роли клеточных киназ в цикле ре­пликации вируса гриппа, следует также упомя­нуть об исследовании Konig et al. [27], в котором при помощи полногеномного скрининга были идентифицированы 295 клеточных факторов, необходимых для репликации вируса. Большая часть этих белков является киназами, то есть ферментами, регулирующими большинство кле­точных сигнальных путей. В дальнейшем путем анализа стандартной библиотеки из 300 киназ [37] были изучены ингибиторы киназ широко­го спектра, в результате чего идентифицировано вещество ON108110, эффективно ингибирующее 25 из 300 проанализированных киназ. При этом 8 из них оказались ранее охарактеризованы как необходимые для репликации вируса.

Дальнейшее тестирование показало, что ON108110 угнетает ядерный экспорт вирус­ных рибонуклеопротеинов и/или репликацию вирусных РНК, частично воздействуя также на клеточные механизмы транскрипции. Одна­ко вирусный полимеразный комплекс оказался гораздо более чувствителен к воздействию пре­парата, что позволяет использовать его в до­зах, лежащих ниже порога токсичности. Кроме того, ON108110 снижал продукцию двух других РНК-геномных вирусов — вируса везикулярного
стоматита и вируса болезни Ньюкасла, что ука­зывает на его роль в ингибировании киназ, не­обходимых для репродукции не только вируса гриппа, но и других вирусов.

Одной их форм реакции клеток на стрессор- ные воздействия является аутофагия — высо­коконсервативный для всех эукариотических клеток процесс. Исходно аутофагия была иден­тифицирована как процесс, индуцированный голоданием клетки. Однако к настоящему време­ни известно, что он играет важную роль в физио­логии и патофизиологии и является клеточным ответом на самые разные стимулы, в том числе на вирусную инфекцию. Он также может играть роль в поддержании репродукции вируса гриппа в клетках. В условиях угнетения аутофагических процессов фармакологическими препаратами или при помощи РНК-интерференции выход вирусного потомства и синтез вирусных белков значительно снижаются. Аутофагия, таким об­разом, является одним из ключевых процессов, обеспечивающих репликацию вируса гриппа.

Zhou et al. [64] было показано, что гриппозная инфекция запускает в зараженных клетках обра­зование аутофагосом и стимулирует синтез бел­ка LC3-II — специфического маркера этих орга- нелл. Обработка таких клеток 3-метиладенином или вортманнином — ингибиторами аутофа- гии — снижала выход вирусных частиц в 2—5 раз, а инфекционность вирусного потомства — при­близительно на порядок. Сходные результаты были получены при инактивации гена LC3 при помощи специфических siRNA. Механизмы по­добных взаимоотношений вируса и клетки оста­ются до конца не выясненными.

Группой исследователей [7] была даже скон­струирована система скрининга противогрип­позных препаратов на основе анализа взаимо­действия между компонентами аутофагического пути. Способность химических соединений уг­нетать взаимодействие белков Atg5, Atg12 и Atg16 была трактована как потенциальная противо­гриппозная активность. На панели из 83 расти­тельных препаратов традиционной китайской медицины было идентифицировано соединение эводиамин (рис. 6) — алкалоид, содержащийся в экстракте эводии (Evodia rutecarpa Benth.) спо­собное ингибировать образование аутофагосом, индуцированное гриппозной инфекцией, а так­же обладающее противовирусной активностью в отношении широкой панели вирусов гриппа разных подтипов. При этом токсичность эво­диамина составила 100 мкг/мл, а показатель 50% эффективной дозы — 1,6 мкг/мл, что дает индекс селективности около 60 и свидетельствует о вы­соком противовирусном потенциале этого сое­динения и возможности дальнейшей оптимиза­ции его структуры для повышения активности.

Рисунок 5. Структура киназного ингибитора ON108110 [37]

Рисунок 6. Структура эводиамина — ингибитора аутофагии, обладающего противогриппозной активностью [7]

Таким образом, как видно из приведенных примеров, помимо воздействия непосредствен­но на вирусные мишени, размножение вируса гриппа может быть подавлено при помощи мо­дуляции клеточных сигнальных путей. Сле­дует отметить, что несмотря ни на доказанный противовирусный потенциал, ни на разрешен­ное клиническое применение, большинство из перечисленных соединений не используется в качестве средства для терапии гриппа. В пер­вую очередь, это связано с высокой комплексно­стью сигнальных путей-мишеней. Подавляющее большинство этих препаратов разработаны для использования в области онкологии, то есть спо­собны вмешиваться в работу важных для клетки и организма сигнальных систем, регулирующих такие принципиальные процессы, как апоптоз, деление и дифференцировка, ангиогенез и т.д. Воздействие на них, помимо ограничения про­дукции вируса, приводит ко многим побочным эффектам, которые могут существенно сдвигать соотношение «выгода/риск» в сторону риска для здоровья. Кроме того, особенности фармаколо­гического рынка диктуют необходимость разде­ления препаратов для лечения опухолей и респи­раторных вирусных инфекций. Иными словами, в практике фармакологии стремятся избегать одним и тем же действующим веществом лечить и онкологические заболевания, и грипп. Эти аспекты в некоторой степени ограничивают раз­работку эффективных противогриппозных пре­паратов, направленных на клеточные мишени.

Некоторые соединения, как было уже упомя­нуто, сочетают в себе несколько типов активно­сти, каждая из которых приводит к снижению вирусной нагрузки, уменьшению интенсив­ности воспалительных процессов, нормализа­ции структуры ткани при тяжелой гриппозной инфекции, и т.п. Так, например, глицирризи- новая кислота (ГК) является эффективным и малотоксичным индуктором IFNy В работе Utsunomiya et al. [57] было показано, что благо­даря этой способности глицирризиновая кис­лота на 100% предотвращает смертность мышей от гриппозной инфекции при заражении дозой вируса A(H2N2) 10 LD₅₀. Параллельная обра­ботка животных антителами к IFNy полностью снимала протективный эффект ГК, что доказы­вает механизм ее защитного действия. С другой стороны [40], показано, что ГК является мощ­ным имуномодулятором. В терапевтических дозах на модели гриппозной инфекции макро­фагов человека, вызванной высокопатогенным вирусом гриппа H5N1, ГК снижала продукцию провоспалительных цитокинов CXCL10, IL-6 и CCL-5, а также ингибировала вирусиндуци- рованный апоптоз. При этом не было отмечено никакого влияния этого соединения на продук­цию вируса в клетках.

Кроме того показано [41], что в клетках A549, являющихся аналогом альвеолоцитов челове­ка, ГК ингибировала репликацию высокопато­генного вируса гриппа H5N1, снижала степень вирусиндуцированного апоптоза клеток и экс­прессию провоспалительных цитокинов. Не­ясно, является ли такая активность следствием или независима от собственно ее противови­русной активности. Известно, что оболочечные вирусы в процессе слияния вирусной и кле­точной мембран нуждаются в определенной текучести липидного бислоя и следовательно, зависят от реологических свойств клеточной мембраны. Так, снижение текучести мембра­ны на 5% ингибировало размножение ВИЧ-1 на 56%, а 5%-ное повышение текучести напро­тив, повышало инфекционность вируса в 2,4 раза [21]. Показано также, что те же закономер­ности применимы и в случае гриппозной ин­фекции [61]. В высоких концентрациях ГК пре­пятствует интернализации вирионов гриппа, взаимодействуя с мембранами и снижая их те­кучесть. Эти свойства объясняют также актив­ность ГК in vitro в отношении других вирусов — SARS-ассоциированного коронавируса, ВИЧ-1, респираторно-синцитиального вируса, вируса гепатита В, арбовирусов, вируса осповакци­ны, вирусов группы герпеса (вирус варицелла- зостер, вирус простого герпеса 1 типа, вирус Эпштейна—Барр, цитомегаловирус, вирус сар­комы Капоши) и вируса везикулярного стома­тита [15]. В дополнение к уже описанным ме­ханизмам подавления вирусной репродукции, известно, что ГК снижает мембранный транс­порт и сиалирование поверхностного антигена вируса гепатита В, а также ингибирует фермен­ты фосфорилирования при инфекции, вызван­ной вирусом везикулярного стоматита [15].

Таким образом, несмотря на противоречивые сведения о наличии у ГК прямой противови­русной активности в отношении вируса гриппа, можно говорить, что она является, тем не менее, потенциально важным компонентом комплекс­ной противогриппозной терапии благодаря на­личию других типов биологической активности, важных при лечении тяжелой и осложненной инфекции. В наших собственных исследова­ниях [1, 2] продемонстрирована протективная активность ГК против вирусов гриппа A(H1N1) pdm09 и A(H3N2). Снижение титра вируса в тка­ни легких при этом составило приблизительно 1 порядок. При этом достоверного противови­русного действия в культуре клеток MDCK от­мечено не было. Добавление к ГК иммуномоду­лирующего дипептида а-глутамилтриптофана повышало противовирусную активность ком­бинации, снижая вирусный титр на 5—6 по­рядков по сравнению с контролем и гибель жи­вотных — на 77%. Таким образом, комбинация двух препаратов, неактивных in vitro, имела вы­раженный эффект in vivo, и механизмы этой ак­тивности следует расшифровывать в дальней­ших исследованиях.

Преимущества описанного подхода к терапии гриппа очевидны. В отличие от этиотропных соединений, против которых вирус способен вырабатывать устойчивость, препараты против клеточных мишеней лишены этого недостат­ка. По сравнению с вирусом гриппа, клетка — гораздо более сложная система, обладающая многими уровнями контроля за возникнове­нием мутаций и их коррекции, вплоть до гибе­ли клетки, несущей эти изменения. Во-вторых, в дополнение к антивирусной активности, мно­гие препараты этой группы обладают други­ми видами биологической активности — про­тивовоспалительной, цитопротекторной и др. Такая активность не столь важна в случаях за­болеваний средней тяжести, однако становит­ся жизненно важной, когда речь идет о случаях позднего, тяжелого и осложненного гриппа, где ведущую роль в патогенезе играют не вирусные, а реактивные процессы. Список препаратов — потенциальных кандидатов для комплексной терапии гриппа, разумеется, не исчерпывается соединениями, перечисленными в настоящем обзоре. С развитием представлений о патогенезе гриппозной инфекции как о сложном процессе, включающем связанные и взаимозависимые ка­скады реакций, появляются основания включать все больше число ингибиторов каждого из них в число лекарств, способных нормализовать течение гриппа. Сюда относятся статины, ин­гибиторы ангиотензин-конвертирующего фер­мента и блокаторы ангиотензинового рецептора, агонисты рецепторов, активируемых перокси- сомными пролифераторами и агонисты АМФ- активируемых протеинкиназ, и др. [14].

В настоящем обзоре мы ограничились те­рапией одной только гриппозной инфекции. Описанные соединения, однако, воздействуют на процессы, общие для тяжелых воспалитель­ных заболеваний, независимо от конкретной этиологии — продукцию провоспалительных цитокинов, миграцию клеток в очаг воспаления, и т.п. Поэтому следует ожидать, что соединения, активные при гриппе, окажутся также эффек­тивными и при других вирусных заболеваниях сходного патогенеза, как это имеет место в слу­чае ГК. Следовательно, дальнейшие исследова­ния в области поиска и оптимизации ингибито­ров клеточных компонентов как средств против гриппозной инфекции могут привести к разра­ботке новых противовирусных препаратов высо­кой эффективности, широкого спектра действия и низкой вероятности развития резистентности.

Таким образом, препараты для терапии грип­позной инфекции следует разделять как по меха­низмам действия, так и по срокам применения. Во-первых, это препараты, наиболее эффектив­ные для профилактики и экстренной профилак­тики (интерфероны и их индукторы). Во-вторых, это препараты этиотропного механизма, ис­пользование которых необходимо на всех сроках гриппа после постановки диагноза, но эффек­тивно лишь на ранних стадиях заболевания. На­конец, в-третьих, на дальних стадиях и в случаях тяжелой и осложненной инфекции необходимо использование соединений патогенетического механизма действия, которые могут снижать или не снижать собственно вирусную репродукцию. При этом применение препаратов, действующих на систему врожденного иммунитета, является абсолютно целесообразным как в раннем перио­де терапии, так и в более поздние сроки, при этом сочетанное применение специфических и не­специфических препаратов представляет собой оптимальный путь повышения эффективности терапии гриппа.

Дополнительная информация о МБНПК Цитомед: клинические исследования препаратов.

Литература: