Факторы роста и молекулы адгезии эндотелия сосудов как молекулярные мишени для создания пептидных лекарственных препаратов против атеросклероза

В основе развития атеросклероза лежит дисфунк­ция эндотелиальных клеток, которые регулируют тонус сосудов, модулируют гемостаз, влияют на со­судистую проницаемость и контролируют рост кро­веносных сосудов |2. 3|. Роль эндотелия в регуляции этих функций опосредована экспрессией сигнальных молекул, важнейшими из которых являются факторы роста и молекулы адгезии |4|.

Наиболее хорошо изученными представителями группы факторов роста, регулирующих функцио­нальную активность эндотелиоцитов, являются тромбоцитарный фактор роста (PDGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF) и трансформирующий фактор роста (TGFp) |5|. PDGF является молекулой, регулирующей клеточный цикл; участвует в процессе свертывания крови и опосредованно влияет на про­лиферацию клеток сосудистого эндотелия. Среди белков, синтез которых индуцируется в фибробластах при добавлении PDGF, ключевым является bFGF. Этот аспект имеет важное значение в механизме раз­вития атеросклероза, когда сопряженно вследствие патологических изменений тромбоцитов, макрофа­гов и гладкомышечных клеток эндотелиоциты вы­рабатывают PDGF. bFGF и TGFp. С другой стороны, эндотелиальные клетки являются мишенями факто­ров роста. Например, митоз эндотелиальных клеток индуцируется bFGF 110|.

Основные эффекты TGFp при атеросклерозе связаны с усилением хемотаксической активности моноцитов, стимуляции синтеза белков экстрацсл- люлярного матрикса, модуляции протеолитической и миграционной активности клеток, а также ингиби­рованием пролиферации и поддержанием дифферен­цированного состояния клеток |8|. При исследовании роли цитокина TGFp в регуляции процессов, сопро­вождающих межклеточные взаимодействия в ходе развития атеросклеротического поражения аорты человека, изучение экспрессии TGFp. а также белков Smad 2. 3, 4. служащих специфическими маркерами транскрипционной активности клеток, возникаю- шей в ответ на сигнал TGF(i, показало, что система TGFp в нормальной интиме магистральных артерий не активна |6|. Система активируется при атероскле­розе на стадии образования липофиброзной бляшки, когда сигнальный путь TGFp (Smad) вовлечен в ре­гуляцию транскрипции, пролиферации и дифференцировки моноцитов/макрофагов и гладкомышечных клеток 1111.

Другим фактором, определяющим склонность к образованию атеросклеротических бляшек, яв­ляется адгезивная способность эндотелия сосудов. При развитии атеросклероза адгезию моноцитов и нейтрофилов на поверхности эндотелия активиру­ют молекулы адгезии Е-селектин и ICAM-I |7|. При этом активированные нейтрофилы активируют перекрестное окисление белков и липидов. Роль селск- тинов в развитии атеросклероза подчеркивается тем фактом, что у мышей, дефинитных по Е-селектину. при скрещивании с мышами, лишенными этого гена (knockout – КО), не происходит развития атероскле­роза. Синтез молекул адгезии могут индуцировать цитокины. Так. интерлейкин-1 и фактор некроза опухолей усиливают синтез эндотелиальными клет­ками VCAM-I и ICAM-I |9|.

Кроме тою, установлено, что с возрастом в об­ластях с высокой степенью полиплоидии эндотели­альных клеток существенно возрастают адгезивные свойства эндотелия, что может обусловливать локаль­ность межклеточных взаимодействий (лейкоциты – эндотелий) и способствовать развитию атероскле­ротических поражений в этих зонах. Исследование экспрессии молекул адгезии (ICAM-I и Е-селектина) для лейкоцитов, проникающих в интиму на ранних этапах атерогенсза, выявило прямую зависимость между степенью полиплоидии и уровнем экспрессии этих молекул.

Таким образом, поиск веществ, молекулярны­ми мишенями действия которых являются факто­ры роста и молекулы адгезии, позволит расширить перспективы в создании лекарственных препаратов, способных успешно предотвращать развитие атеро­склеротического поражения сосудов.

Целью работы явилось изучение влияния пептида Lys-Glu-Trp 111 на экспрессию факторов роста и мо­лекул адгезии в клетках эндотелия сосудов при атеро­склерозе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материал аорты без патологических изменений был получен от эмбриона человека (21 нсд гестации). Ткань атеросклеротической аорты человека (диа­метром 0.2 см. 4 фрагмента) получена при операции аортокоронарного шунтирования. Материал брали в стерильных условиях, затем помешали его в стерильную емкость с физиологическим раствором.

Путем ферментативной диссоциации с помощью коллагеназы из фрагментов сосудов была получена первичная диссоциированная культура ткани эндо­телия. Выделение первичной культуры осушествляли на чашках Петри (Sarstedt). обработанных раствором фибриногена (Gibco), последующее культивирова­ние проводили во флаконах объемом 50 мл (Sarstedt. 25 см²).

Среда для культивирования клеток содержа­ла 87.5% М199, 10% FBS. 1.5% HEPES. 1% PES и L-глутамин. Пассирование клеток производили через 3 дня на 4-й, посевная концентрация составляла при­мерно 3*10′ клеток на флакон. Культивирование проводили до 3-го пассажа (для эндотелия, пораженного атеросклерозом) и до 7-го пассажа (для нормального эндотелия), на котором клетки были рассеяны на 24-луночный планшет для иммунопитохимического окрашивания.

Все культуры (нормального и пораженного атеро­склерозом эндотелия) были разделены на 3 группы:

1-я – контрольная (без введения трипептида). 2-я – с добавлением трипептида в концентрации 4 мкг/мл и 3-я — с добавлением трипептида в концентрации 40 мкг/мл.

Для иммуноиитохимического исследования ис­пользовали первичные моноклональные антитела к маркерам ICAM-I (1:200. LifeSpan). Е-селектину (1:50. Santa Cruz), PDGF (1:50, Dako). bFGF (1:50, Dako). TGFp (1:50. Dako) и вторичные антитела – биотинилированные антимышиные иммуноглобу­лины (Dako). Пермеабилизанию проводили 0,5% раствором тритона Х100. Визуализацию реакции выполняли с применением пероксидазы хрена и диаминобензилина («EnVision Detection System*, Peroxidase/DAB. Rabbit. Mouse). Результаты иммуноцитохимического окрашивания оценивали мор­фометрическим методом на микроскопе «Nikon Eclipse*» Е400с помощью цифровой камеры «Nikon* DXMI200 и программного обеспечения «Videotest Morphology 5.2». В каждом случае анализировали 5 полей зрения при ><200. Площадь экспрессии рас­считывали как отношение плошали, занимаемой иммунопозитивными клетками, к обшей плошали клеток в поле зрения и выражали в %.

Статистическая обработка данных включала подсчет среднего арифметического, стандартного отклонения и доверительного интервала для каж­дой выборки и проводилась в программе Statistics 6.0. Для анализа вида распределения использовали критерий Шапиро-Уилка. Для проверки статисти­ческой однородности нескольких выборок были использованы непараметрические процедуры од­нофакторного дисперсионного анализа (критерий Крускала-Уоллнса). В случаях, когда дисперсион­ный анализ выявлял статистически значимую не­однородность нескольких выборок, для последую­щего выявления неоднородных групп применяли процедуры множественных сравнений с помощью U-критерия Манна-Уитни. Критический уровень достоверности нулевой гипотезы об отсутствии раз­личий принимали равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В контрольной группе в культурах клеток нор­мального эндотелия экспрессия маркеров ICAM-I. Е-селектина. bFGF и TGFp была в 2-8 раз выше, чем соответствующие показатели для эндотел ионитов, полученных от пациентов с атеросклерозом (см. та­блицу).

При этом экспрессия фактора роста PDGF в нор­мальных эндотелиоцитах и пораженных атероскле­розом эндотел ионитах достоверно не различалась. Таким образом, на молекулярном уровне функцио­нальная активность эндотел ионитов при развитии атеросклероза значительно снижается, что выража­ется в снижении экспрессии ряда сигнальных моле­кул – маркеров адгезии и клеточного роста ICAM-1, Е-селектина, bFGF, TGFp, однако протеин PDGF оказывается не вовлеченным в этот процесс. Иссле­дуемый в культуре нормальных эндотелиоцитов три-пептид оказывал разнонаправленное действие в кон­центрациях 4 и 40 мкг/мл: в меньшей концентрации ом способствовал снижению плошали экспрессии Е-селектина на 67%. а в большей – повышал синтез протеина PDGF на 32% по отношению к соответ­ствующему контролю. В культурах клеток эндотелия, полученных от пациентов с атеросклерозом сосудов, трипептид в концентрациях 4 и 40 мкг/мл оказывал однонаправленное ингибирующее действие на экс­прессию сигнальных молекул Е-селектина. bFGF и PDGF (см. таблицу).

ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДА LIS-GLU-TPL НА ПЛОЩАДЬ ЭКСПРЕССИИ МОЛЕКУЛ АДГЕЗИИ И ФАКТОРОВ РОСТА В ЭНДОТЕЛИИ СОСУДОВ В НОРМЕ ПРИ АТЕРОСКЛЕРОЗЕ

Полученные данные свидетельствуют о том, что из всех изученных сигнальных молекул мишенью действия пептида Lys-Glu-Trp в большей степени является Е-селектин, синтез которого, однако, не коррелирует с развитием атеросклеротического пора­жения сосудов. Таким образом, установлено, что мо­лекулы адгезии и факторы роста участвуют в развитии атеросклероза, а измерение уровня их экспрессии в культуре эндотелиоцитов может служить адекватной моделью для поиска биологической активности по­тенциальных лекарственных средств пептидной при­роды.

Литература: