Влияние комбинированного препарата глицирризиновой кислоты и глутамил-триптофана на течение контактного дерматита у крыс

Цель. В эксперименте на крысах планировали оценить влияние топического препарата Тиладерм, в состав которого включены глицирризиновой кислоты натриевая соль и глутамил-триптофана натриевая соль, на течение контактного дерматита (КД).

Материал и методы. Исследование проводили на белых крысах Вистар. КД индуцировали аппликацией спиртово-ацетонового раствора 2,4-динитрохлорбензола (ДНХБ) в течение 4 дней. Затем на индуцированный ДНХБ очаг поражения кожи 1 раз в день в течение 14 дней наносили композицию глицирризиновой кислоты и глутамил-триптофана в мазевой основе типа «масло в воде». Тяжесть КД оценивали по состоянию очага поражения, морфологическому составу крови и показателям апоптоза в очаге.

Результаты. Аппликации раствора ДНХБ привели к развитию у крыс КД, проявившегося папуловезикулярными высыпаниями, экскориациями, корками на поверхности очага. Использование топического препарата Тиладерм позволило снизить время регресса поражения кожи, происходившего уже к концу 14-го дня лечения. Показано, что в очаге КД наблюдалась активация маркеров апоптоза (Ki-67, в меньшей степени — p53, каспаза-3, bcl-2). На фоне лечения препаратом Тиладерм экспрессия Ki-67 снижалась, а экспрессия p53 и каспазы-3 — увеличивалась.

Выводы. Препарат Тиладерм проявил отчетливое позитивное действие на течение экспериментального КД у крыс.

Характерной чертой современной цивилизации является нарастание интенсивности воздействия ксенобиотических факторов окружающей среды на орга­низм человека. химическая промышленность синтезирует огромное количество различных токсичных со­единений, используемых в производстве химических красителей, синтетических волокон, средств для борь­бы с вредителями [1]. В той или иной мере токсичные продукты химических производств могут попадать во внешнюю среду, продукты питания, воду и т. д. и воз­действовать на организм человека. Результатом этого воздействия является устойчивая тенденция к увели­чению числа заболеваний токсико-аллергической при­роды и, в частности, к появлению контактных дерма­титов (КД), для которых характерно хроническое тече­ние и устойчивость к терапии [2].

В этой связи особую актуальность приобретает по­иск новых средств лечения таких состояний. Одним из таких направлений является поиск новых препаратов противовоспалительной и иммуномодулирующей направленности, таких как производные солодки [3, 4], и иммунорегуляторных пептидов-тимомиметиков, в частности дипептида глутамил-триптофан [5]. Ранее нами уже было показано, что глицирризиновая кисло­та и глутамил-триптофан по отдельности и особенно в комбинации изменяют процессы апоптоза в очаге КД, развившегося в ответ на аппликацию 2,4-дини­трохлорбензола (ДНхБ) [6]. Выявленные изменения можно было трактовать как процессы репарации острого повреждения кожи, вызванного токсическим воздействием ДНхБ.

Целью настоящей работы явилась оценка влияния топического препарата Тиладерм, в состав которого включены глицирризиновой кислоты натриевая соль и глутамил-триптофана натриевая соль, на течение КД, индуцированного ДНхБ.

Материал и методы

эксперименты проведены на 60 крысах-самцах Вистар с массой тела 200—220 г, выращенных в питом­нике РАН «Рапполово». До эксперимента животных подвергали 14-дневному карантину и рандомизации. Животных содержали в условиях вивария на стан­дартном рационе. эксперименты выполняли согласно существующим требованиям лабораторной практики [7, 8].

Моделирование КД. Контактный дерматит (КД) воспроизводили по модифицированной методике п.М. залкан и Е.А. Иевлева [9] путем двукратных ап­пликаций ДНхБ, который наносили в виде 5% спир­тово-ацетонового раствора на выстриженные участки боковой поверхности тела крыс в течение 4 дней.

Схема эксперимента. Все животные случайным образом были разделены на 4 группы:

• интактные животные, не подвергавшиеся ника­ким воздействиям, — 6 крыс;
• контрольная группа (контроль) — животные с воспроизведенным КД без лечения — 18 крыс;
• опытная группа (Тиладерм) — животные с вос­произведенным КД с ежедневным нанесением на очаг поражения препарата Тиладерм — 18 крыс;
• группа сравнения (плацебо) — животные с вос­произведенным КД с ежедневным нанесением на очаг поражения только мазевой основы — 18 крыс.

Спустя 4 сут. после первой аппликации ДНхБ на образовавшиеся очаги поражения КД начинали на­носить препарат Тиладерм, представляющий собой фармакологическую композицию, содержащую 2% глицирризиновой кислоты тринатриевой соли и 0,05% глутамил-триптофана натриевой соли в мазевой осно­ве. В качестве плацебо использовали мазевую осно­ву, не содержавшую активных компонентов.

Препараты наносили ежедневно 1 раз в сутки в течение 14 дней. На протяжении всего эксперимента ежедневно оценивали тяжесть развившегося дерма­тита по изменению показателей кожного покрова — величины кожной складки и тяжести кожных проявле­ний. Тяжесть кожных проявлений выражали в баллах: 0 — отсутствие реакции; 0,5 — появление локаль­ных очагов гиперемии; 1 — выраженная гиперемия; 2 — гиперемия и отечность; 3 — резкое покраснение и отек; 4 — образование эрозий; 5 — образование ге­моррагической корки.

Величину скорости оседания эритроцитов (СОэ), количество лейкоцитов и процентное соотношение субпопуляций ядросодержащих клеток в перифериче­ской крови определяли по общепринятым методам.

Экспрессию маркеров апоптоза — белков p53, bcl-2, cpp32 (caspase-3), Ki-67 определяли в парафи­новых срезах биоптатов кожи в помощью двухэтап­ного авидин-биотинового метода с использованием антител к p53, bcl-2, cpp32, Ki-67 и визуализирующей системы фирм Dako и Novocastra по методикам про­изводителя. Интерпретацию результатов проводили с помощью светового микроскопа полуколичествен­ным методом, в котором интенсивность иммунопози­тивной реакции оценивали степенью интенсивности окраски — отрицательная (—), положительная (+). Результат выражали в виде доли окрашенных клеток (в каждом случае определяли в 3 сериях наблюдения, подсчет вели в 100 клетках каждой серии).

Общая продолжительность наблюдения после мо­делирования КД составляла 14 дней. Оценку тяжести проявлений в очаге КД и измерение толщины кожной складки производили ежедневно. показатели периферической крови определяли перед началом терапии, а также на 7-й и 14-й дни лечения. показатели апопто­за в разных слоях кожи в очаге КД определяли одно­кратно на 14-й день терапии.

Статистическая обработка. полученные результа­ты обрабатывали с использованием статистической программы Statistica 6.0. Различия между выборками оце­нивали с помощью критериев Манна — Уитни, Крускала — Уоллиса. Для проведения статистических расчетов использовалась программа Microsoft Excel 2003.

Результаты обсуждения

К исходу 4-суточного периода аппликаций ДНхБ на коже крыс формировался очаг КД, характеризовавшийся папуловезикулярными высыпаниями, экс­кориациями и образованием толстой, плотной и глу­бокой геморрагической корки (рис. 1). В зоне очага и прилегающих участках кожи развивались отек и ин­фильтрация клетками воспалительного ряда, что про­являлось увеличением кожной складки, толщина кото­рой достигла 4,5—5,0 мм, в то время как у интактных животных она составляла 2,0—2,1 мм (различия до­стоверны при р < 0,05; табл. 1). Тяжесть кожных про­явлений составила 4,8 ± 0,1 балла (у интактных живот­ных она равна 0, различия достоверны при p < 0,05). этот день был принят за 1-й день терапии, когда жи­вотным опытной группы начали наносить препарат Тиладерм непосредственно на очаг КД 1 раз в сутки, крысам группы сравнения таким же образом наносили плацебо, контрольные животные никакого лечения не получали.

Рис. 1. Состояние кожного покрова крыс после 4 аппликаций ДНХБ

У животных контрольной группы позитивные изме­нения развивались к 11-му (рис. 2, а) дню наблюдения и проявлялись снижением тяжести кожных пораже­ний в среднем в 2,5 раза (табл. 1). Толщина кожной складки также уменьшилась в 2,8 раза относительно показателя 1-го дня. В этот же период у 30% крыс из данной группы наблюдалось практически полное от­торжение геморрагической корки, сформировавшейся в период аппликаций ДНхБ, у остальных животных сохранялись отдельные фрагменты корки. полное отторжение корки у всех животных завершилось к 14-му дню наблюдения, однако в этот период в очаге КД со­хранялась гиперемия и незначительное увеличение толщины кожной складки (рис. 2, б).

Рис. 2. Состояние кожного покрова крыс из контрольной группы на 11-й (а) и 14-й (б) дни наблюдения

Таблица 1 Влияние изучаемых препаратов на течение КД (М ± m)

Примечание. Здесь и в табл. 2 и 3: достоверность различий р < 0,05: * — от показателей интактных животных; ** — от показателей контрольных животных; # — от показателей группы плацебо.

У животных, которым на очаг КД наносили Тила- дерм, уже через 24 ч. после первой аппликации отмеча­лось достоверное уменьшение толщины кожной складки (см. табл. 1), при том что тяжесть поражения была сопоставима с таковой у контрольных животных и в груп­пе плацебо. На 4-й день терапии отмечено достоверное улучшение состояния очага КД в группе Тиладерм по сравнению с показателями контрольных животных и крыс в группе плацебо. Геморрагическая корка нача­ла отторгаться уже с 5-го дня терапии, т. е. в 2 раза быстрее, чем у контрольных животных (рис. 3, а). На 11-й день у всех животных, получавших аппликации Тиладерма, наблюдалось полное восстановление внешнего вида и морфологии кожных покровов (рис. 3, б).

Рис. 3. Состояние кожного покрова крыс, леченных препаратом Тиладерм, на 5-й (а) и 11-й (б) дни наблюдения

В группе плацебо отторжение корки начиналось с 8-го дня, т. е. в 1,25 раза быстрее, чем в контроле, но в 1,6 раза медленнее, чем у крыс, получавших Тила­дерм. показатель тяжести поражения имел более ди­намичный характер, и различия между группами Тиладерм и плацебо исчезли начиная с 8-го дня лечения, в то время как различия между группами по показа­телю толщины кожной складки сохранялись до 13-го дня лечения. что касается сравнения динамики репа­ративного процесса в очаге КД между контрольными животными и крысами группы плацебо, то здесь от­мечалась динамика, аналогичная по направленности, но более растянутая по времени. Так, различия между группами Тиладерм и плацебо по тяжести поражения и толщине кожной складки исчезали уже к 11-м сут­кам, в то время как различия между показателями контрольных животных и крыс группы плацебо сохра­нялись до 14-го дня.

Таким образом, на основании клинической оценки течения КД у крыс, не получавших лечения (контроль), и у крыс, получавших аппликации исследуемого пре­парата (Тиладерм) или мазевой основы (плацебо), можно сделать вывод о том, что Тиладерм оказывал отчетливое терапевтическое воздействие, проявляв­шееся достоверно более быстрым регрессом пора­жения кожи. препарат плацебо в этом эксперименте также оказывал определенное терапевтическое дей­ствие, но оно было существенно меньшим, чем при аппликации Тиладерма.

В процессе наблюдения исследовали также из­менения показателей периферической крови живот­ных, получавших терапию препаратом Тиладерм, и животных, которым аппликации этого препара­та не проводили (табл. 2). перед началом терапии у всех животных, у которых моделировали КД, от­мечена типичная реакция на воспаление, проявляв­шаяся двукратным увеличением СОэ, достоверным лейкоцитозом, увеличением процентного содержа­ния нейтрофилов с нерезким, но достоверным сдви­гом влево. Отмечено также достоверное повышение содержания эозинофилов. Количество лимфоцитов у животных опытных групп было достоверно ниже, чем у интактных. Исследование СОэ и клеточного состава периферической крови, выполненное на 7-й день лечения, показало существенную динамику в группе крыс, которым на очаг наносили Тиладерм. Так, значение СОэ снизилось до уровня, отмечен­ного у интактных крыс. Одновременно снизилась выраженность лейкоцитоза. процентное содержа­ние основных субпопуляций лейкоцитов практиче­ски достигало уровня, характерного для интактных крыс. что касается показателей в группах контроля и плацебо, то здесь выявлены достоверные отличия от показателей у интактных животных: сохранялись высокая СОэ и лейкоцитоз. процентное содержа­ние сегментоядерных нейтрофилов и эозинофилов было достоверно выше, а лимфоцитов — ниже, чем у интактных животных.

Таблица 2 Влияние препарата на показатели периферической крови (М ± m)

Измерения, выполненные в день окончания исследования (14-е сут.), показали полное восстановле­ние всех показателей в группах Тиладерм и плацебо. В контрольной группе сохранялся небольшой нейтрофилез и нерезкая лимфопения.

Полученные результаты дают основание считать, что в ответ на аппликации ДНхБ в коже развивается КД, который сопровождается общей воспалительной реакцией с изменениями клеточных показателей периферической крови. Аппликации препарата Тиладерм сопровождаются быстрым уменьшением интенсивности воспалительного ответа и репарацией кожных поражений. Так, уже в 7-му дню наблюдения остаются лишь некоторые резидуальные реакции. Напро­тив, у животных, не получавших какого-либо лечения, воспалительный процесс уменьшается существенно медленнее и к 14-му дню сохраняются остаточные яв­ления общей реакции на кожное поражение. что ка­сается ответа организма на плацебо, то позитивная реакция, несомненно, наблюдается, однако она про­текает существенно медленнее, чем при аппликации Тиладерма.

На завершающем этапе эксперимента была прове­дена оценка состояния апоптоза в разных слоях кожи в очаге КД (табл. 3). У животных контрольной группы в клетках воспалительного ряда наблюдалось резкое увеличение экспрессии маркера клеточной пролифе­рации Ki-67, достигавшее максимума в сосочковом слое. Наряду с этим наблюдали достоверное увеличе­ние экспрессии белка р53, cpp-32 и антиапоптогенного белка bcl-2, достигавшее максимума в эпителии при­датков кожи.

Таблица 3 Содержание маркеров апоптоза в разных слоях кожи в очаге КД на 14-й день лечения (доля окрашенных клеток на 100 просмотренных, %, M ± m)

Экспрессия р53 и cpp-32 на фоне аппликаций пре­парата Тиладерм увеличивалась во всех компартментах кожи в среднем в 1,6—3,5 раза. Отмечено также уменьшение экспрессии bcl-2, наиболее выраженное в поверхностном эпителии и эпителии придатков. В глу­боких слоях экспрессия данного маркера была существенно снижена. Изменения экспрессии маркеров апоптоза в эпидермисе из очага КД в группе плацебо были сходны с показателями в контрольной группе. Вместе с тем выраженность этих изменений была ни­же, чем в контрольной группе, но выше, чем в группе Тиладерм. Иначе говоря, по структуре изменений показателей апоптоза группа плацебо занимает проме­жуточное положение между группой контроля и группой Тиладерм, что соответствует данным по другим исследованным показателям.

Таким образом, полученные результаты позволяют утверждать, что репаративный потенциал, выявленный у препарата Тиладерм, обусловлен входящими в него активными компонентами: глицирризиновой кислотой и глутамил-триптофаном. Мазевая основа также оказывает позитивное действие, однако оно выражено значительно меньше и может быть связано с увлажняющим и смягчающим действием компонентов, образующих мазевую основу.

Выводы

1. Комбинированный топический препарат, со­держащий натриевые соли глицирризиновой кислоты и глутамил-триптофана, показал выраженное репара­тивное действие в модели КД, индуцированного аппликациями ДНХБ.
2. Показано, что противовоспалительное и репара­тивное действие препарата обусловлено именно активными лекарственными веществами, а не мазевой основой препарата.

Литература: