Изменения функций эндотелиальных клеток человека под влиянием имихимода in vitro

Имихимод (1-(2-метилпропил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-4-амин) известен как активный иммуномодулятор с антивирусными свойствами. Кроме его стимулирующего влияния на клеточно-опосредованный иммунитет в моделях in vivo обнаружены его антивирусные и антиангиогенные эффекты. Возможность непосредственного влияния имихимода на свойст­ва эндотелиальных клеток оставалась неизученной. В данном исследовании показано, что имихимод ингибирует пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток человека ли­нии EA.hy 926 in vitro. Дополнительно показано, что имихимод индуцирует апоптоз, но не некроз эндотелиальных клеток и продукцию ими цитокина ИЛ-6. Полученные резуль­таты позволяют предположить, что имихимод способен ингибировать ангиогенез за счет прямого воздействия на функции эндотелиальных клеток.

В настоящее время одной из наиболее актуальных задач экспериментальных исследований является изучение новых возможностей целенаправленной ингибиции ангиогенеза, процесса формирования капиллярных сосудов, который способствует опу­холевому росту и метастазированию. Имихимод (R-837, S-26308) входит в новую группу низкомо­лекулярных препаратов имидазолхинолинаминов, относится к числу иммуномодуляторов и обладает противовирусной и противоопухолевой активностью [1,5,6]. Ранее показано антиангиогенное действие имихимода in vivo, которое является результатом суммарного эффекта препарата в организме на клетки иммунной системы, опухолевые клетки и, возможно, на эндотелиальные клетки [2-4].

Цель исследования — изучить непосредст­венное влияние имихимода (1-(2-метилпропил)- 1 Н-имидазо[4,5-с]хинолин-4-амин) на функции эн­дотелиальных клеток линии EA.hy 926, которые по основным генотипическим и фенотипическим ха­рактеристикам соответствуют клеткам макрососу­дов человека. В работе оценивали влияние пре­парата in vitro на ангиогенные свойства эндоте­лиальных клеток — пролиферацию, миграцию, апоптоз и секрецию цитокинов.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Линия эндотелиальных клеток человека EA.hy 926 (предоставлена докт. Cora-Jean С.Edged, Универ­ситет Северной Каролины). Клетки культивиро­вали в среде DMEM/F12 (“Биолот”) с необходи­мыми добавками (“Биолот”), при 37°С во влажной атмосфере с 5% С0₂.

Пролиферацию клеток (5×10³ клеток/100 мкп на лунку) оценивали после 96-часовой инкубации в присутствии или без имихимода в культуральной среде, содержавшей 2.5% сыворотки. За 24 ч до окончания инкубации вносили раствор бромдез- оксиуридина (BrdU, 1:2000). После встраивания метки клетки фиксировали с одновременной де­натурацией и проводили иммунодетекцию с по­следующим учетом оптической плотности при А=450 нм согласно рекомендациям производите­лей коммерческой тест-системы (“Calbiochem”). Параллельно часть проб окрашивали 0.2% раст­вором кристаллического фиолетового, содержав­шим 10% метанола, с последующими отмывками, экстракцией красителя 10% раствором уксусной кислоты и учетом при А=570 нм. Индекс пролифе­рации (ИП) рассчитывали как процентное отноше­ние оптической плотности в пробах, содержавших тестируемые образцы, к оптической плотности конт­рольных образцов.

Интенсивность апоптоза и некроза эндотели­альных клеток оценивали после 24-часовой инку­бации в присутствии или без имихимода, с после­дующими дезинтеграцией монослоя и окрашива­нием клеточной суспензии аннексином V, меченным ФИТЦ, и 7-аминоактиномицином-0 (7-AAD), сле­дуя инструкциям коммерческих наборов (“Beckman Coulter”). Измерение образцов проводили с по­мощью проточного цитофлюориметра “Coulter Apics Altra” (“Beckman Coulter’).

Для оценки влияния препарата на миграцию эндотелиальных клеток использовали метод огра­ниченного механического повреждения конфлю­энтного монослоя с помощью пластикового шпа­теля, создающего свободную от клеток площадь шириной 0.5 мм. После 24 ч инкубации в присутст­вии имихимода или культуральной среды с по­следующей фиксацией клеток и окрашиванием по Романовскому, интенсивность миграции оценива­ли микроскопически (“Axio Observer D1 ”, “Zeiss”), документируя с помощью цифровой фотосъемки. С помощью программы “AxioVision” рассчитывали индекс ингибиции миграции (ИИП) — процентное отношение площади, оставшейся свободной от мигрировавших эндотелиальных клеток, к исход­ной площади свободной от клеток непосредствен­но после повреждения монослоя.

Секрецию цитокинов в культуральной жид­кости эндотелиальных клеток после 24 ч инкуба­ции изучали методом ИФА с помощью коммер­ческих тест-систем (“Цитокин”).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Влияние имихимода на пролиферацию эндотели­альных клеток человека линии ЕА. hy 926 изучали двумя независимыми методами. Исходный препа­рат растворяли в ДМСО и вносили в культуральную среду так, чтобы конечная концентрация раство­рителя во всех пробах составляла 0.2%. Обнару­жено выраженное, статистически достоверное и дозозависимое антипролиферативное действие имихимода в концентрациях 1-100 мкМ (табл. 1). После 96-часовой инкубации в присутствии ими­химода максимально сниженные ИП составляли 44.62±15.70 и 64.05+4,06% (по результатам встраи­вания бромдезоксиуридина и окрашивания с по­мощью кристаллического фиолетового соответ­ственно). Собственного действия ДМСО по срав­нению с контрольными лунками, содержавшими культуральную среду, в данных эксперименталь­ных условиях не обнаружено.

Таблица 1. Влияние имихимода на пролиферацию эндотелиальных клеток линии ЕА. hy 926 (n-20, М±m)

Примечание. *р<0.001 — различия между средними значе­ниями ИП в контрольных лунках (спонтанная пролиферация с 0.2% ДМСО) и в присутствии имихимода.

Методом проточной цитофлюориметрии изуча­ли влияние имихимода на апоптоз и некроз эндо­телиальных клеток. Количество клеток, находящих­ся в состоянии апоптоза, оценивали по экспрессии фосфотидилсерина с помощью специфического и высокоаффинного связывания аннексина V. Ко­личество апоптотических клеток при культивиро­вании в стандартных условиях не превышало 5% от всей популяции. После 24 ч инкубации с 100 мкМ имихимода количество клеток линии ЕА. hy 926 в состоянии апоптоза достоверно увеличилось и со­ставило 12.730+3.015% (табл. 2). Количество эндо­телиальных клеток в состоянии некроза при куль­тивировании в стандартных условиях составляло не более 1.4%, как было показано с помощью ок­рашивания 7-AAD, свободно проникающим в ядро при разрушении цитоплазматической и ядерной мембран, где связывается с G=C ДНК, что харак­терно для некроза и поздней стадии апоптоза. По­сле культивирования эндотелиальных клеток в присутствии имихимода количество клеток, на­ходившихся в состоянии некроза, достоверно не изменялось (табл. 2).

Таблица 2. Влияние имихимода на апоптоз и некроз эндотелиальных клеток линии ЕА. hy 926 (n=6, M+SD)

Примечание. *р<0.01 — различия между средними значе­ниями контрольных проб (спонтанный апоптоз с 0.2% ДМСО) и средними значениями в присутствии имихимода.

Имихимод значительно и дозозависимо инги­бировал миграцию эндотелиальных клеток в зону ограниченного механически поврежденного моно­слоя (рисунок). После 24 ч инкубации в присутствии 25 и 100 мкМ имихимода индексы угнетения мигра­ции, которые рассчитывали, оценивая площадь повреждения, свободную от мигрировавших кле­ток, составляли 63.45±11.76 и 76.60±12.52 соот­ветственно и достоверно отличались от контроль­ных индексов угнетения миграции клеток в при­сутствии 0.2% ДМСО (39.61 ±10.33; M±SD, п=15).

Дополнительно показано достоверное и дозо­зависимое индуцирующее влияние имихимода на продукцию ИЛ-6 эндотелиальными клетками. По­сле 24-часовой инкубации в присутствии 100 мкМ имихимода уровни продукции ИЛ-6 клетками ли­нии ЕА. hy 926 составляли 56.51 ±2.49 пг/мл и досто­верно отличались от контрольных уровней продукциив присутствии 0.2% ДМСО и от спонтанной про­дукции цитокина в культуральной среде (34.27±3.42 и 34.28±2.61 пг/мл соответственно).

Влияние имихимода на миграционную активность эндо­телиальных клеток (х90)

Миграция клеток линии EA.hy 926 в зону механически поврежденного монослоя: а — исходное положение после повреждения монослоя; б — спонтанная миграция эндо­телиальных клеток после 24-часовой инкубации (конт­роль культуральной среды); в — миграция в присутствии 100 мкМ имихимода; г — миграция в присутствии 25 мкМ имихимода; д — миграция в присутствии 6.25 мкМ ими­химода. Окрашивание по Романовскому.

В целом результаты убедительно демонстри­руют способность’имихимода непосредственно влиять на функциональную активность эндотели­альных клеток человека in vitro. На примере клеток линии ЕА. hy 926 показано ингибирующее действие имихимода на пролиферацию и миграцию эндо­телиальных клеток, что в комплексе с индуцирую­щим действием на апоптоз этих клеток указывает на антиангиогенные свойства тестируемого препа­рата, ранее известного, главным образом, благода­ря противовирусному действию [5]. В литературе активно обсуждается возможность антиангиоген- ного и противоопухолевого действия имихимода вследствие его иммунорегуляторных эффектов и/ или непосредственного влияния на опухолевые клетки [1,2,4,6]. Полученные нами результаты рас­ширяют представления об антиангиогенном по­тенциале имихимода. Механизмы его действия на эндотелиальные клетки предстоит изучить.

Литература: