Влияние комбинации глутамил-триптофана с глицирризиновой кислотой на течение острой инфекции у мышей, вызванной вирусом гриппа (H3N2)

В. С. Смирнов¹, В. В. Зарубаев², П. М. Анфимов², А. А. Штро²

¹ЗАО «ЦитоНИР», России, Санкт-Петербург

²ФГБУ НИИ гриппа Минздравсоцразвития России, Санкт-Петербург

Журнал «Вопросы вирусологии», 2012. №3. – С.23-27

2012 Тимоген

Скачать PDF

Цель исследования – определить модулирующее действие глутамил-триптофана (EW), глицирризиновой кислоты тринатриевой соли (ГКТС) и их комбинации на течение экспериментальной инфекции, вызванной вирусом гриппа A(H3N2) у мышей. Животные были инфицированы вирусом гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) в дозе 1 или 10 LD₅₀. ГКТС (10 мг на 1 кг массы тела) и EW (0,1, 10 и 1000 мкг/кг) по отдельности и в сочетании друг с другом применяли внутрибрюшинно в течение 5 дней, начиная с 1-го дня после заражения вирусом. В качестве препарата сравнения использовали ремантадин в дозе 50 мг/кг. Установлено, что комбинация EW (1000 мкг/кг) и ГКТС (10 мг/кг) оказывала максимальное защитное действие, проявлявшееся снижением смертности инфицированных животных (на 75-79% по сравнению с контролем в зависимости от дозы вируса), титра накопления вируса в легких (5-6 lg ЭИД₅₀), а также предотвращением отека и воспаления ткани легких. Отмеченный эффект был сопоставим с таковым при применении ремантадина. Монопрепараты обладали меньшей эффективностью по сравнению с ремантадином. Полученные результаты позволяют рассматривать комбинацию ГКТС + EW как перспективное средство для лечения гриппа.

Каждый год вирусы гриппа вызывают массовые вспышки заболеваний во всех регионах планеты. Наиболее восприимчивая часть населения – дети школьного возраста. одновременно с этим грипп является причиной дополнительной смертности среди пожилых людей в эпидемическом сезоне [7]. имеется достаточно данных, свидетельствующих о связи между вспышкой гриппа и количеством больных, госпитализированных или умерших от острой пневмонии или хронических сердечно-легочных болезней и других состояний, которые могут быть следствием заболевания гриппом [10, 11].

Противогриппозная вакцинация представляет собой оптимальный метод повышения устойчивости к инфекции, однако она эффективна только против штамма вируса с конкретным антигенным составом [9]. Несмотря на развитую систему мониторинга гриппа, не исключена возможность появления и быстрого распространения разновидности вируса, не соответствующей штаммовому составу вакцины.

Не менее важное значение имеет химиотерапия гриппа. Этиотропные фармакологические препараты – ремантадин, озельтамивир и рибавирин – могут снизить интенсивность и продолжительность инфекции, однако они обладают токсичностью и дают ряд побочных эффектов [2, 14]. Кроме того, вирусы гриппа способны вырабатывать резистентность к таким наиболее распространенным противовирусным препаратам, как производные адамантана (амантадин и ремантадин) и озельтамивир [12]. Таким образом, для контроля гриппозной инфекции необходимы новые противовирусные стратегии.

одним из подобных направлений является применение препаратов иммуномодулирующей природы [4, 8]. К числу соединений, применявшихся для профилактики и лечения гриппа, относятся в частности дипептид глутамил-триптофан (EW), более известный как Тимоген® [6], бендазол и комбинированный препарат Цитовир-3 [4, 5], многочисленные индукторы интерферона [1], моноклональные антитела разной специфичности [8], а также экстракты солодки и их производные [15]. Имеющиеся данные [4] свидетельствуют о том, что значительная часть этих средств наиболее эффективна в качестве мер экстренной профилактики, применяемых либо в инкубационном периоде, либо в первые часы после инфицирования. По мере формирования клинической картины гриппа эффективность препаратов снижается, хотя даже в этой ситуации риск развития постинфекционных осложнений достоверно уменьшается. Сравнительные исследования эффективности Тимогена®, бендазола и их комбинации показали, что комбинированный препарат существенно превосходит по эффективности каждый из входящих в него компонентов [4]. Эти результаты согласуются с существующим мнением о том, что сочетание в одной композиции соединений, модулирующих разные иммунные реакции, более эффективно, чем каждый из образующих ее компонентов [8]. В связи с этим очевидный интерес представляет сочетание тимомиметика EW, предположительно являющегося агонистом метаботропного глутаматного рецептора, и глицирризиновой кислоты, подавляющей экспрессию провоспалительных цитокинов за счет ингибирования активности толл-подобных рецепторов TLR-3 и TLR-4 [13]. Способность каждого из этих соединений уменьшать тяжесть течения экспериментальной гриппозной инфекции хорошо документирована [4, 15]. В связи с изложенным представляет несомненный интерес исследование противоинфекционных свойств глицирризиновой кислоты тринатриевой соли (ГКТС), EW и их комбинации в отношении вируса гриппа in vivo на модели летальной гриппозной пневмонии у животных при введении в период манифестации инфекционного процесса (лечебная схема применения).

Материалы и методы

Препараты. В работе использовали ГКТС, глутамил-триптофана (EW) натриевую соль (ЗАО “МБНПК “Цитомед”, Санкт-Петербург). В качестве референс-препарата применяли ремантадин (а-метил- 1-адамантил-метиламина гидрохлорид, «Aldrich Chem. Co.”, Milw., Wl, cat. # 39.059-3).

Вирус. Использовали адаптированный к мышам вирус гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2). Вирус пассировали в аллантоисной полости 10-12-дневных куриных эмбрионов в течение 48 ч при 36°C.

Животные. Белых беспородных мышей (самки) массой 12-16 г получали из питомника «Рапполово» (Ленинградская обл.) и содержали на стандартном рационе в условиях вивария НИИ гриппа РАМН. Подбор животных в группы опыта производили методом случайной выборки. До начала испытаний животные находились под наблюдением в течение 1 нед.

Экспериментальная гриппозная инфекция. Для заражения животных была использована вируссодержащая аллантоисная жидкость куриных эмбрионов. Из нее готовили серию 10-кратных разведений на физиологическом растворе, после чего инфекционную активность вируса в заражающем материале определяли в отдельном эксперименте при помощи титрования по летальности на животных. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча.

Исследуемые препараты вводили животным внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл по лечебной схеме (1 раз в сутки в течение 5 дней, начиная с 1-х суток после инфицирования). Препарат сравнения применяли по той же схеме. Дозы препаратов: ГКТС – 10 мг на 1 кг массы животных, EW – 1000, 10 и 0,1 мг/кг, ремантадин – 50 мг/кг. В качестве плацебо животных контрольной группы вводили физиологический фосфатный буфер. В качестве отрицательного контроля использовали интактных животных, которые содержались в тех же условиях, что и опытные группы.

Вирусы вводили животным интраназально под легким эфирным наркозом по 1 LD₅₀ (25 мышей на группу) и 10 LD₅₀ (20 мышей на группу). На 3-й день после заражения 10 животных из каждой группы умерщвляли, вскрывали и изолировали легкие. Из этих 10 легких 5 использовали для выделения вируса (замораживали и хранили при -20°C до постановки соответствующих экспериментов), оставшиеся 5 легких фиксировали 10% забуференным формалином и использовали для гистологического анализа (см. ниже). легкие животных, инфицированных вирусом в дозе 10 LD₅₀, использовали только для выделения вируса.

Наблюдение за оставшимися животными осуществляли в течение 14 дней, т. е. срока, на протяжении которого ежедневно фиксировали массу и смертность животных в контрольных и опытных группах.

На основании полученных показателей смертности в каждой группе рассчитывали процент смертности (М), индекс защиты (IP) и среднюю продолжительность жизни животных (MDD) из расчета 14 дней наблюдения в соответствии со следующими формулами:

MDD = (I N • D)/Nt,

где N – количество животных, проживших D дней, Nt – общее число животных в группе;

M = M/Nt,

где M – число животных в группе, павших в течение 14 дней после заражения;

IP = ((Mc – Me)/Mc) х 100%,

где Mc и Me – смертность (в %) в контрольной и опытной группах соответственно.

Титрование вируса в легочной ткани. Для определения инфекционного титра вируса гриппа в легочной ткани животных легкие мышей, извлеченные на 3-и сутки после инфицирования, гомогенизировали в 10-кратном объеме стерильного физиологического фосфатного буфера и готовили из гомогенатов серии 10-кратных разведений на том же буфере. При определении титра вируса гриппа использовали культуру клеток MDCK (ATCC # CCL-34), выращенных на 96- луночных панелях на среде МЕМ. Клетки заражали серийными 10-кратными разведениями легочного гомогената от 10⁰ до 10^-7 и инкубировали в термостате в течение 48 ч. По окончании срока инкубации культуральную жидкость переносили в лунки планшета для иммунологических реакций, после чего добавляли равный объем 1% суспензии куриных эритроцитов в физиологическом растворе.

Уровень репродукции вируса в лунках панели оценивали по реакции гемагглютинации (РГА) эритроцитов. За титр вируса принимали величину, противоположную десятичному логарифму наибольшего разведения вируса, способного вызвать положительную реакцию гемагглютинации, и выражали в логарифмах 50% экспериментальной инфекционной дозы вируса (lg ЭИД50).

Гистологический анализ. Для морфологического исследования легкие фиксировали 10% формалином на фосфатном буфере, затем готовили препараты по стандартной методике с заливкой в парафин. Депарафинированные срезы окрашивали гематоксилином и эозином. В полученных препаратах оценивали интенсивность и клеточный состав воспалительного инфильтрата в очагах пневмонии и определяли степень дегенеративных и пролиферативных процессов в ткани легких.

Проявления бронхиолита и отека легких оценивали в окрашенных срезах легких полуколичественно по следующим критериям: 0 – клетки занимают от 0 до 25% поля зрения (что характерно для структуры интактных легких), 1 – 25-50% (умеренный отек), 2 – 50-75% (выраженный отек), 3 – 75-100% (тотальный отек легких). В каждой группе препараты просматривали в 10-20 полях зрения.

Статистическая обработка данных. Статистическую обработку результатов (расчет средних значений и стандартных отклонений) проводили при помощи программы Microsoft Excel. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента. различия между группами считали достоверными, если значение p не превышало 0,05.

Результаты

Протективная активность препаратов в опытах на животных. В ходе опыта не была зарегистрирована неспецифическая смертность в контрольной группе интактных животных. Клинические признаки заболевания были типичными для гриппозной инфекции: затрудненное дыхание, атаксия, тремор, снижение потребления корма и воды.

Данные о динамике смертности животных в контрольных и опытных группах, уровне репродукции вируса в ткани легких и влиянии препаратов на степень воспалительных процессов и отека легких суммированы в таблице.

инфицирование животных вирусом приводило к дозозависимой смертности в группах опыта, начиная с 6-х суток после инфицирования. Применение препаратов ГКТС и EW и ремантадина приводило к снижению смертности и повышению продолжительности жизни животных. В наибольшей степени эффект был выражен при введении EW в максимальной дозе (1 мг/кг) и комплекса EW и ГКтС (индексы защиты 41 и 77% соответственно). В последнем случае защитный эффект препаратов превосходил таковой ремантадина.

Влияние препаратов на репродукцию вируса. В ткани легких модельный вирус размножался до титров 6,9-7,3 lg ЭИД₅₀/20 мг ткани в зависимости от инфицирующей дозы. Применение ГКтС не влияло на репродукцию вируса в ткани, однако использование EW приводило к достоверному снижению инфекционной активности вируса в легких, причем ингибирующий эффект не зависел от наличия в смеси ГКтС. Это относилось как к малой, так и к высокой инфицирующей дозе вируса.

Морфологический анализ. У зараженных мышей, не получавших лечение, морфологические изменения легочной ткани на 6-е сутки после инфицирования характеризовались скоплением нейтрофилов и клеточного детрита в просветах крупных бронхов, вирусспецифическим поражением клеток бронхиального эпителия с формированием в них вирусных включений и отторжением пораженных клеток в просвет бронха, интенсивным серозным интерстициальным отеком, очагами геморрагического отека, нейтрофильной инфильтрацией и распадом клеток в респираторных отделах, расширением сосудов и спадением альвеол (рис. 1, см. 2-ую полосу обложки). Значительная часть нейтрофилов при этом находилась в стадии распада. Перечисленные явления типичны для интенсивно протекающей вирусной пневмонии, и степень их выраженности может служить критерием для оценки тяжести процесса.

При введении исследуемых препаратов морфологическая структура легких животных, прошедших лечение, была сходной с таковой у контрольных животных. Основное отличие от животных, не получавших лечения, заключалось в резком ограничении признаков вирусспецифического и реактивного поражения ткани легких в острой стадии гриппозной пневмонии. так, на 6-е сутки после инфицирования клетки бронхиального эпителия выглядели сохранными (рис. 2, а; см. 2-ую полосу обложки) в отличие от разрушенных клеток с многочисленными вирусными включениями у контрольных животных. Сами очаги воспаления занимали меньшую по сравнению с контролем площадь (рис. 2, б). Согласно полученным данным наиболее выраженное восстановление структуры ткани легких наблюдалось на фоне EW (1000 мкг/кг) в комбинации его с ГКтС (рис. 3, а; см. 2-ую полосу обложки). в данном случае активность этой комбинации была сопоставима с активностью ремантадина (рис. 3, б). остальные сочетания препаратов оказывали сходное или меньшее влияние на морфологию легких при гриппозной пневмонии.

Влияние EW и ГКТС на показатели гриппозной пневмонии, вызванной вирусом гриппа A/Aichi/2/68 (H3N2) у белых мышей

tabl71

Примечание. Жирным шрифтом выделены значения, отличающиеся от контрольных при уровне достоверности 95%; н/о – не определяли.

Количественно степень поражения легочной ткани животных контрольных и опытных групп была также оценена при микроскопическом исследовании легких. Было установлено (см. таблицу), что наибольшее влияние на отек и воспалительную инфильтрацию легких отмечалось при использовании ГКтС в комбинации с EW (1000 мкг/кг), что хорошо коррелирует с результатами вышеописанных тестов.

Обсуждение

Полученные результаты доказали правомерность первоначальной гипотезы относительно более высокой эффективности комбинированного препарата, состоящего из EW и ГКтС, в сравнении с каждым из компонентов по отдельности. При использовании комбинированного препарата, содержащего 10 мг/кг ГКтС и 1 мг/кг EW, выживаемость инфицированных животных была несколько выше, чем животных, получавших ремантадин. Увеличение выживаемости на фоне введения исследованной комбинации сопровождалось отчетливой тенденцией к снижению титра вируса в легких и соответственно нормализации гистологической картины легких.

Дипептидные производные активно разрабатываются в последнее время в качестве противовирусных препаратов. Наиболее интересными среди них являются дипептиды, имеющие клеточные мишени и воздействующие на патологический процесс при вирусной инфекции опосредованно – через иммуномодуляцию, индукцию интерферона и т. п. [3]. Эти соединения не проявляют выраженные противовирусные свойства в клеточных культурах, однако имеют высокую активность при экспериментах на животных, что обусловлено взаимодействием многих клеточных популяций в процессе реализации механизма их действия. в этом смысле EW, использованный в данном исследовании, можно отнести к группе препаратов, эффективность которых обусловлена взаимодействием с системой врожденного иммунитета. С этой позиции сочетание EW с ГКтС полностью оправдано, поскольку производные солодки также реализуют свои свойства преимущественно через паттернраспознающие рецепторы, но иного типа, чем EW. таким образом, комбинация этих двух соединений позволяет в максимальной степени мобилизовать систему врожденного иммунитета на защиту от патогенного вируса. Полученные результаты позволяют рассматривать комбинацию ГКТС + EW как перспективное средство для лечения гриппа.

Литература:

Ершов Ф. И. Антивирусные препараты. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006.
Киселев О. И., Деева Э. Г., Слита А. В., Платонов В. Г. Антивирусные препараты для лечения гриппа и ОРЗ. Дизайн препаратов на основе полимерных носителей. – СПб., 2000.
НосикН. Н., Лаврухина Л. А., КондрашинаН. Г. и др. Интерферониндуцирующая и противовирусная активность дипептидов // Вопр. вирусол. – 2010. – Т. 55, № 3. – С. 41-43.
Смирнов В. С., Селиванов А. А. Биорегуляторы в профилактике и лечении гриппа. – СПб.: Наука, 1996.
Смирнов В. С. Профилактика и лечение гриппа и острых респираторных вирусных инфекций. – СПб.: ФАРМИндекс, 2010.
Хавинсон В. Х., Синакевич Н. В., Серый С. В. Тимоген. – СПб., 1991.
Clark N. M., Lynch J. R. Influenza: epidemiology, clinical features, therapy, and prevention // Semin. Respir. Crit. Care Med. – 2011. – Vol. 32, N 4. – P. 373-392.
Darwish I., MubarekaS., Liles W. C. Immunonodulatory therapy for severe influenza // Expert. Rev. Anti. Infect. Ther. – 2011. – Vol. 9, NP. 807-822.
Kent J. H., Chapman L. E., Schmelts L. M. et al. Influenza surveillance – United States, 1991-1992 // Morbid. Mortal. Wkly Rep. – Vol. 41. – P. 35-46.
MadjidM., Miller C. C., Zarubaev V. V. et al. Influenza epidemics and acute respiratory disease activity are associated with a surge in autopsy-confirmed coronary heart disease death: results from 8 years of autopsies in 34 892 subjects // Eur. Heart J. – 2007. – Vol. 28, N 10. – P. 1205-1210.
Perotta D. M., Decker M., Glesen W. P. Acute respiratory disease hospitalization as a measure of impact of epidemic influenza // Am. J. Epidemiol. – 1985. – Vol. 122. – P. 468-476.
Pizzorno A., Abed Y., Boivin G. Influenza drug resistance // Semin. Respir. Crit. Care Med. – 2011. – Vol. 32, N 4. – P. 409-422.
Schrofelbauer B., Raffetseder J., Haunter M. et al. Glkycyrrhizin, the main active compound in liquorice, attenuates pro-inflammatory responses by interfering with membrane-dependent receptor signaling // Biochem. J. – 2009. – Vol. 421, N 3. – P. 473-482.
Upton D. A., Aoki F , Stiver H. G. The use of antiviral drugs for influenza: Recommended guidelines for practitioners // Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. – 2006. – Vol. 17, N 5. – P. 273-284.
Utsunomiya T., KobayashiM., PollardR. B., Suzuki F Glycyrrhizin, an active component of licorice roots, reduces morbidity and mortality of mice infected with lethal doses of influenza virus // Antimicrob. Chemother. – 1997. – Vol. 41, N 3. – P. 551-556.