Гастропротекторная активность аналогов дипептида глутамил-триптофана и мелатонина

В экспериментах на крысах-самцах изучено гастропротекторное действие синтети­ческих дипептидов глутамил-триптофана (EW), изовалероил-глутамил-триптофана (ivEW), никотиноил-глутамил-триптофана (nEW) и мелатонина при приеме внутрь на моделях стрессорной и индометациновой язвы желудка. Установлено, что EW и мела­тонин обладают гастропротекторной активностью при профилактическом применении на модели стрессорной язвы желудка, а ivEW, nEW, EW и мелатонин — при лечебной схеме применения на модели язвы желудка, вызванной введением индометацина. Мак­симальным гастропротекторным действием обладал ivEW при лечебной схеме приме­нения. В основе терапевтической эффективности препаратов лежит их цитопротектор­ное, антиоксидантное и иммуномодулирующее действие.

ВВЕДЕНИЕ

Гастропатии, язвенная болезнь желудка и двенадца­типерстной кишки (ЯБЖДК), гиперацидные и стрес­совые гастриты широко распространены среди трудо­способного населения, что объясняет большую меди­цинскую и социальную значимость проблемы [1]. Сложность проблемы заключается в том, что, несмот­ря на применение эффективных методов лечения ЯБЖДК, возникновение рецидивов отмечается в 60- 100 % случаев. Полипрагмазия наряду со стрес­сом обусловливает дополнительное местнораздражаю­щее и альтерирующее действие в отношении желудоч­но-кишечного тракта у пожилых пациентов (использо­вание НПВС для лечения заболеваний опорно-двига­тельного аппарата и пр.).

Базисная фармакотерапия гастропатий включает следующие группы лекарственных средств: блокаторы рецепторов гистамина и протонной помпы, антациды; антигеликобактерные препараты; гастропротекторы [2].

В связи с тем что фармакотерапия ЯБЖДК пред­ставляет немалые трудности, поиски более совершен­ных по механизму действия и клиническим результа­там лекарственных средств (ЛС) могут быть плодо­творны только с учетом накопленных сведений о пато­генетических механизмах заболевания, а также долговременного опыта использования препаратов в клинике. Идеальным решением является создание ЛС с системным и местным гастропротекторным действи­ем. Повышение резистентности слизистой оболочки
желудка (СОЖ) и двенадцатиперстной кишки (СОДК) может быть достигнуто за счет активации антиоксидантной системы, нормализации психосоматического компонента, достаточной обеспеченности организма нутриентными факторами [1,3]. Важная роль отводит­ся регуляции работы трех жизненно важных и взаимосвязанных систем: нервной, иммунной и эндокринной [4]. В последние годы в медицинской практике возник­ло новое направление в терапии язвенно-эрозивных поражений ЖКТ природными (флавоноиды, феноль­ные соединения) и синтетическими (пробукол и др.) антиоксидантами, что обусловлено их позитивным влиянием на “оксидативный” стресс [1, 3]. Изучается роль иммунной системы в реализации гастропротек­торных эффектов синтетических аналогов пептидов тимуса и мелатонина [5-7].

В настоящем исследовании предстояло оценить эф­фективность назначаемых внутрь глутамил-триптофа­на (EW), аналогов EW: изовалероил-глутамил-трипто- фана (ivEW), никотиноил-глутамил-триптофана (nEW) и мелатонина при экспериментальной язве желудка, вызванной стрессом и индометацином, в сравнении с гастропротекторами мизопростолом и сукралфатом.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили на 274 аутбредных кры­сах-самцах линии Sprague-Dawley с массой тела 180 -200 г, выращенных в питомнике РАН “Рапполо- во”. До экспериментов животных подвергали 14-днев­ному карантину и рандомизации. Животных содержа­ли в условиях вивария на стандартном рационе. Экс­перименты выполняли согласно требованиям этиче­ского комитета [8, 9].

Моделировали два варианта гастропатии: стресс-яз­ву желудка по Селье и язвообразование при введении индометацина. За 24 ч до стресса или применения уль- церогена животных лишали пищи при свободном дос­тупе к воде, так как голодание вследствие активации анаэробного гликолиза способствует снижению уров­ня факторов защиты в слизистой желудка. Моделиро­вали язвообразование по Селье: животных иммобили­зировали в плексигласовых пеналах при температуре 4 °С в течение 3-х часов. Ульцерогенную дозу индоме­тацина (10 мг/кг) вводили в течение трех последова­тельных дней внутримышечно на стерильном апиро- генном физиологическом растворе [10, 11]. Пептиды и препараты сравнения в указанных ниже эффективных дозах вводили в желудок за 1 ч и 7 дней до моделиро­вания стрессорной язвы по Селье (профилактическая схема) или вводили в желудок в течение 7 дней от мо­мента моделирования индометациновой язвы желудка (лечебная схема). Животные контрольной группы по­лучали эквиобъемные количества растворителя в соот­ветствующих режимах.

В каждой серии были сформированы следующие экспериментальные группы по 10 – 12 животных: 1 — интактные крысы; 2 — животные с патологией, полу­чавшие физиологический раствор (контроль); 3 — животные с патологией, получавшие препарат сравнения (мизопростол, сукралфат); 4 — животные с патологией, получавшие мелатонин или один из исследуемых пептидов. На основании анализа данных литературы [1 – 3, 5-7] были выбраны следующие дозы препара­тов для исследования: EW-0,1; 1 и 10 мкг/кг; мелато­нин — 0,3 и 3 мг/кг; мизопростол — 50 мкг/кг; сукрал­фат — 200 мг/кг. Синтетические пептиды ivEW и nEW исследовали в релевантных EW дозах.

По окончании иммобилизации по Селье и проведе­ния экспериментальной терапии животных умерщвля­ли [9] путем мгновенной декапитации, желудки извле­кали, вскрывали по большой кривизне, промывали физиологическим раствором и макроскопически при яр­ком вертикальном освещении определяли число деструкций, которые дифференцировали по площади их поверхности на мелкие (М) диаметром менее 1 мм, средние (С) округлые и полосовидные от 1 мм и круп­ные (К) более 1-2 мм. Размер деструкций СОЖ определяли с помощью цифрового микроскопа “Expert Prima” (ЛОМО, Россия). Наличие крови на дне деструкций выявляли в пероксидазной реакции с субстра­том ортодианизидина гидропероксида с подкраской слизистой метиленовым синим. При этом гемсодержа­щая поверхность окрашивалась в коричнево-черный цвет на синеватом фоне интактной слизистой.

Учитывали распределение животных в группе с де­фектами слизистой оболочки по степени выраженно­сти макроскопических изменений, проводили расчёт индекса Паулса (ИП) по формуле: (среднее количество язв х % животных с язвами)/100 % и гастропротектор­ную активность (ГА): отношение ИП в контрольной группе к ИП в опытной группе. Изучаемый препарат считали активным, если ГА составляла 2 и более еди­ниц. Биохимически оценивали в 10 % гомогенатах СОЖ уровень малонового диальдегида (МДА), глута­тиона и активность миелопероксидазы (МПО) обще­принятыми методами [12 – 14]. Для проведения гисто­логического исследования участки стенки желудка фиксировали в 10 % растворе формалина через 2 ч по­сле взятия образцов и полного расслабления гладкой мускулатуры. Срезы окрашивали гематоксилин-эози­ном. Микроскопическое изучение препаратов стенки желудка проводили на микроскопе B-350 (“Optika”, Италия).

Статистическую обработку проводили с помощью программ Excel и Statistica 6.0. Результаты в таблицах представляли в виде M + а. Различия между группами оценивали с помощью критериев непараметрических методов анализа вариаций в соответствии с инструк­циями к программам обработки данных и считали значимыми при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для EW и мелатонина ранее было показано наличие стресс-протекторных свойств [5 – 7]. В связи с этим на первом этапе эксперимента была исследована их гас­тропротекторная активность на модели стрессорной язвы по Селье. После иммобилизации животных на холоде в слизистой желудка происходили следующие патологические изменения: развитие гиперемии, парез и дилатация мышц гастрии, образование эрозий и язв, рефлюкс желчи и фибринозный налет.

EW, мелатонин и препарат сравнения мизопростол при профилактическом введении проявляли гастропротекторную активность, выраженную в различной степени. Результаты представлены в табл. 1.

Таблица 1. Влияние EW и мелатонина на язвообразование при стрессе по Селье (n = 10)

Примечание. * — отличия значимы по сравнению с контролем приp < 0,05; ** — позитивные отличия значимы по сравнению с мизопростолом при p < 0,05. М — мелатонин; К — крупные язвы, С — средние язвы, М — мелкие язвы; ИП — индекс Паулса, ГА — гастропротекторная активность.

При однократном введении мелатонин обладал уме­ренной гастропротекторной активностью (3 мг/кг; ГА = 2). Он обеспечивал снижение числа язвенных де­фектов СОЖ среднего (в 2 раза) и малого (в 1,9 раза) размеров. Отмечена дозовая зависимость гастропро­текторного действия мелатонина. Однако по действию мелатонин существенно уступал активности мизопростола. EW при однократном введении крысам не обладал гастропротекторной активностью и не снижал числа животных с язвенными дефектами.

Семидневный профилактический курс мелатонина оказывал достаточное гастропротекторное действие (ГА = 3), немного отличающееся от такового при одно­кратном введении этого гормона. В дозе 3 мг/кг мела­тонин уменьшал число деструкций СОЖ: крупные язвы практически отсутствовали, а число средних и мелких было существенно ниже, чем в контрольной группе животных. Полученные данные подтверждают роль мелатонина в развитии и ограничении стресс-ре­акции и соматической патологии [5, 15].

Анализ полученных данных показал, что профилак­тическое введение EW крысам в течение недели до стресса оказывало гастропротекторное действие, со­поставимое с действием мизопростола, а при введении в дозе 1 мкг/кг — превосходящее таковое. EW обладал
максимальной гастропротекторной активностью (в дозе 0,1 мкг/кг ГА = 27; в дозе 1 мкг/кг ГА = 50), превосходя эффекты мизопростола и мелатонина. Выяв­ленные гастропротекторные свойства EW, отличающиеся от таковых у мелатонина, а также тот факт, что при однократном введении для EW не была выявлена гастропротекторная активность, свидетельствуют об участии иммунной и антиоксидантной системы в реализации гастропротекторного действия этого пептида при многократном применении.

В связи с выявленной выраженной гастропротек­торной активностью EW при профилактическом применении в следующей серии было проведено расши­ренное изучение эффективности этого дипептида и его модифицированных аналогов при лечебном примене­нии на модели индометациновой язвы желудка.

Установлено, что моделирование язвы желудка пу­тем введения индометацина в упьцерогенной дозе сопровождается развитием значимых патологических изменений у крыс через 3-е суток от момента затравки. На 7-е сутки животные теряли до 30 % массы тела от фоновых значений, что было связано как с потерей крови в результате желудочных кровотечений, так и с активизацией катаболизма. У всех животных из контрольной группы отмечали выраженную гиперемию и появление деструкций в слизистой оболочке желудка: значительное количество поверхностных и глубоких эрозий и отек околоэрозивной поверхности. На дне большинства деструкций выявлено наличие гем-положительного материала (кровь: гематин и метгемоглобин вследствие кровоизлияния обнаженных подслизи­стых капилляров и окисления гемоглобина соляной кислотой желудочного сока). Значимое снижение мас­
сы тела отмечали в следующих случаях использования препаратов: в контроле, при введении EW и nEW в дозе 10 мкг/кг — у 100 % животных в группе. Наи­большим протекторным действием обладал ivEW в дозе 0,1 мкг/кг; EW и nEW, вводившиеся дозе 0,1 мкг/кг, по этому показателю были сопоставимы. На фоне введения сукралфата происходило сущест­венное снижение, как числа, так и площади язвенных дефектов. Гиперемия слизистой была отмечена у 40 % животных.

Результаты оценки влияния изучаемых препаратов на количество деструкций в слизистой оболочке же­лудка животных представлены в табл. 2.

Таблица 2. Влияние модифицированных аналогов EW на процесс язвообразования у животных на модели индометациновой язвы же­лудка (n = 12)

Примечание. * — отличия значимы по сравнению с контролем при p < 0,05; ** — позитивные отличия значимы по сравнению с сукралфатом при p < 0,05. М — мелатонин; К — крупные язвы, С — средние язвы, М — мелкие язвы; ИП — индекс Паулса, ГА — гастропротекторная активность.

Введение EW в различных дозах в желудок препят­ствовало образованию язв желудка. Этот эффект в большей мере был выражен на фоне введения в дозе 0,1 мкг/кг как по общему числу язв желудка, так и по количеству крыс с язвами. В дозе 10 мкг/кг препарат достоверно уменьшал число крупных деструкций и не оказал влияния на число средних и мелких язв. Мела­тонин по эффективности приближался к EW, но менее существенно.

Выраженными гастропротекторными свойствами обладал пептид ivEW. На фоне его введения происхо­дило уменьшение индекса Паулса по сравнению с кон­тролем и препаратом сравнения (р < 0,05). В дозе 10 мкг/кг он сопоставим с активностью EW по умень­шению среднего числа деструкций, а по гастропротек­торной активности превосходил действие сукралфата и других препаратов. Пептид nEW, который был со­поставим по ряду показателей с EW, превосходил по ГА сукралфат.

Содержание в СОЖ продуктов перекисного окисле­ния и активность миелопероксидазы на фоне терапии пептидами существенно уменьшались, а уровень глу­татиона увеличивался. Установленные позитивные сдвиги в отношении биохимических показателей функционирования СОЖ под влиянием экспериментальной терапии препаратами характеризуют вклад антиоксидантной системы в реализацию гастропротекторных свойств выбранных соединений [6, 7]. Ре­зультаты представлены в табл. 3.

Таблица 3. Влияние модифицированных аналогов EW на биохимические показатели слизистой оболочки желудка при язвообразова­нии у животных на модели индометациновой язвы желудка (n = 12)

Примечание. ^л — отличия значимы по сравнению с группой интактных крыс при p < 0,05; * — отличия значимы по сравнению с контролем при p < 0,05; ** — позитивные отличия значимы по сравнению с сукралфатом при p < 0,05. М — мелатонин; МДА — малоновый диальдегид, МПО — миелопероксидаза

В контроле происходило значимое увеличение уровня МДА в 2,9 раза, активность миелопероксидазы увеличивалась в 1,9 раза, а уровень глутатиона падал в 2,1 раза по сравнению с интакными крысами (р < 0,05). Это свидетельствовало об ускорении про­цессов свободнорадикального окисления и истощения пула антиоксидантов (за счет ингибирования синтеза протекторных факторов), а также притоке полиморф­
ноядерных лейкоцитов, активированных хлоридной средой, что приводило к увеличению активности миелопероксидазы.

Сукралфат снижал уровень продуктов ПОЛ в 1,6 раза по сравнению с контролем, активность МПО — в 1,5 раза, восстанавливал сниженную концентрацию глутатиона в 1,3 раза в основном за счет связывания и процессов адсорбции на поверхности СОЖ. EW по ак­тивности приближался к сукралфату: на фоне его введения уровень МДА снижался в 2,2 раза (0,1 мкг/кг), по влиянию на МПО и уровень глутатиона был сопоставим с сукралфатом (0,1 мкг/кг). Однако это происхо­дило, вероятно, по другому механизму, отличному от действия препарата сравнения. В дозе 10 мкг/кг EW несколько уступал действию сукралфата.

Наибольшие позитивные сдвиги отмечали у крыс, получавших пептид ivEW. Так, при его введении в дозе 0,1 мкг/кг отмечали значимую нормализацию процессов ПОЛ и активности миелопероксидазы, вос­становление уровня глутатиона (р < 0,05). Но содержа­ние глутатиона в гомогенате СОЖ не достигало значе­ний интактных животных. По активности пептид ivEW существенно превосходил EW, nEW, мелатонин и сукралфат.

При микроскопии окрашенных срезов стенки же­лудков крыс были выявлены патологические измене­ния в слизистой оболочке. В контроле отмечали нали­чие глубоких язвенных дефектов с обнажением мы­шечной пластинки, неглубоких язв (до железистого эпителия), множество поверхностных эрозий. У жи­вотных, получавших сукралфат, отмечали отсутствие глубоких язвенных дефектов и незначительное число поверхностных эрозий. Терапия мелатонином приво­дила к уменьшению числа язвенных дефектов, однако по глубине эти язвы были похожи на таковые, выяв­ленные в контрольной группе. EW оказывал более значимое позитивное влияние на процессы повреждения СОЖ, чем мелатонин. В группах крыс, получавших терапию пептидами ivEW и nEW, зарегистрированы ми­нимальные патологические изменения СОЖ в основном за счет поверхностных эрозий и мелкоточечных участков некроза эпителия.

По величине гастропротекторной активности на мо­дели индометациновой язвы желудка при лечебной схеме введения изучаемые вещества можно располо­жить в следующий ряд в порядке от наиболее активно­го соединения к менее активному: ivEW > nEW > EW « мелатонин.

ВЫВОДЫ

1. Дипептид глутамил-триптофан не оказывает гас­тропротекторного действия при однократном профилактическом применении на модели стрессорной язвы. При семикратном профилактическом введении кры­сам EWвызывает значимое снижение числа язвенных деструкций в желудке крыс, подвергнутых иммобилизационному стрессу по Селье, чем существенно отли­чается от мелатонина.
2. Глутамил-триптофан, изовалероил-глутамил-триптофан, никотиноил-глутамил-триптофан и мелатонин оказывают гастропротекторное действие, выра­женное в разной степени на модели индометациновой язвы желудка у крыс.
3. Изовалероил-глутамил-триптофан обладает наи­большей гастропротекторной активностью в условиях приема ингибитора циклооксигеназы по сравнению с другими препаратами. На фоне экспериментальной те­рапии пептидом отмечается существенное увеличение содержания антиоксидантов, снижение интенсивности процессов липопероксидации в слизистой оболочке желудка.

Литература: