Главная/Синтез пептидов на заказ/Материалы и Исследования/Гастропротекторная активность аналогов дипептида глутамил-триптофана и мелатонина
МАТЕРИАЛЫ&ИССЛЕДОВАНИЯ
Гастропротекторная активность аналогов дипептида глутамил-триптофана и мелатонина
1 ФГУН Институт токсикологии ФМБА России, 192019, Санкт-Петербург, ул. Бехтерева, 1.
2 ООО “ЦитоНИР”, 191023, Санкт-Петербург, Мучной пер., 2.
Журнал «Экспериментальная и клиническая фармакология», 2012. ТОМ 75/№2. – С.17-21
Скачать PDF
В экспериментах на крысах-самцах изучено гастропротекторное действие синтетических дипептидов глутамил-триптофана (EW), изовалероил-глутамил-триптофана (ivEW), никотиноил-глутамил-триптофана (nEW) и мелатонина при приеме внутрь на моделях стрессорной и индометациновой язвы желудка. Установлено, что EW и мелатонин обладают гастропротекторной активностью при профилактическом применении на модели стрессорной язвы желудка, а ivEW, nEW, EW и мелатонин — при лечебной схеме применения на модели язвы желудка, вызванной введением индометацина. Максимальным гастропротекторным действием обладал ivEW при лечебной схеме применения. В основе терапевтической эффективности препаратов лежит их цитопротекторное, антиоксидантное и иммуномодулирующее действие.
ВВЕДЕНИЕ
Гастропатии, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки (ЯБЖДК), гиперацидные и стрессовые гастриты широко распространены среди трудоспособного населения, что объясняет большую медицинскую и социальную значимость проблемы [1]. Сложность проблемы заключается в том, что, несмотря на применение эффективных методов лечения ЯБЖДК, возникновение рецидивов отмечается в 60- 100 % случаев. Полипрагмазия наряду со стрессом обусловливает дополнительное местнораздражающее и альтерирующее действие в отношении желудочно-кишечного тракта у пожилых пациентов (использование НПВС для лечения заболеваний опорно-двигательного аппарата и пр.).
Базисная фармакотерапия гастропатий включает следующие группы лекарственных средств: блокаторы рецепторов гистамина и протонной помпы, антациды; антигеликобактерные препараты; гастропротекторы [2].
В связи с тем что фармакотерапия ЯБЖДК представляет немалые трудности, поиски более совершенных по механизму действия и клиническим результатам лекарственных средств (ЛС) могут быть плодотворны только с учетом накопленных сведений о патогенетических механизмах заболевания, а также долговременного опыта использования препаратов в клинике. Идеальным решением является создание ЛС с системным и местным гастропротекторным действием. Повышение резистентности слизистой оболочки
желудка (СОЖ) и двенадцатиперстной кишки (СОДК) может быть достигнуто за счет активации антиоксидантной системы, нормализации психосоматического компонента, достаточной обеспеченности организма нутриентными факторами [1,3]. Важная роль отводится регуляции работы трех жизненно важных и взаимосвязанных систем: нервной, иммунной и эндокринной [4]. В последние годы в медицинской практике возникло новое направление в терапии язвенно-эрозивных поражений ЖКТ природными (флавоноиды, фенольные соединения) и синтетическими (пробукол и др.) антиоксидантами, что обусловлено их позитивным влиянием на “оксидативный” стресс [1, 3]. Изучается роль иммунной системы в реализации гастропротекторных эффектов синтетических аналогов пептидов тимуса и мелатонина [5-7].
В настоящем исследовании предстояло оценить эффективность назначаемых внутрь глутамил-триптофана (EW), аналогов EW: изовалероил-глутамил-трипто- фана (ivEW), никотиноил-глутамил-триптофана (nEW) и мелатонина при экспериментальной язве желудка, вызванной стрессом и индометацином, в сравнении с гастропротекторами мизопростолом и сукралфатом.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты проводили на 274 аутбредных крысах-самцах линии Sprague-Dawley с массой тела 180 -200 г, выращенных в питомнике РАН “Рапполо- во”. До экспериментов животных подвергали 14-дневному карантину и рандомизации. Животных содержали в условиях вивария на стандартном рационе. Эксперименты выполняли согласно требованиям этического комитета [8, 9].
Моделировали два варианта гастропатии: стресс-язву желудка по Селье и язвообразование при введении индометацина. За 24 ч до стресса или применения уль- церогена животных лишали пищи при свободном доступе к воде, так как голодание вследствие активации анаэробного гликолиза способствует снижению уровня факторов защиты в слизистой желудка. Моделировали язвообразование по Селье: животных иммобилизировали в плексигласовых пеналах при температуре 4 °С в течение 3-х часов. Ульцерогенную дозу индометацина (10 мг/кг) вводили в течение трех последовательных дней внутримышечно на стерильном апиро- генном физиологическом растворе [10, 11]. Пептиды и препараты сравнения в указанных ниже эффективных дозах вводили в желудок за 1 ч и 7 дней до моделирования стрессорной язвы по Селье (профилактическая схема) или вводили в желудок в течение 7 дней от момента моделирования индометациновой язвы желудка (лечебная схема). Животные контрольной группы получали эквиобъемные количества растворителя в соответствующих режимах.
В каждой серии были сформированы следующие экспериментальные группы по 10 – 12 животных: 1 — интактные крысы; 2 — животные с патологией, получавшие физиологический раствор (контроль); 3 — животные с патологией, получавшие препарат сравнения (мизопростол, сукралфат); 4 — животные с патологией, получавшие мелатонин или один из исследуемых пептидов. На основании анализа данных литературы [1 – 3, 5-7] были выбраны следующие дозы препаратов для исследования: EW-0,1; 1 и 10 мкг/кг; мелатонин — 0,3 и 3 мг/кг; мизопростол — 50 мкг/кг; сукралфат — 200 мг/кг. Синтетические пептиды ivEW и nEW исследовали в релевантных EW дозах.
По окончании иммобилизации по Селье и проведения экспериментальной терапии животных умерщвляли [9] путем мгновенной декапитации, желудки извлекали, вскрывали по большой кривизне, промывали физиологическим раствором и макроскопически при ярком вертикальном освещении определяли число деструкций, которые дифференцировали по площади их поверхности на мелкие (М) диаметром менее 1 мм, средние (С) округлые и полосовидные от 1 мм и крупные (К) более 1-2 мм. Размер деструкций СОЖ определяли с помощью цифрового микроскопа “Expert Prima” (ЛОМО, Россия). Наличие крови на дне деструкций выявляли в пероксидазной реакции с субстратом ортодианизидина гидропероксида с подкраской слизистой метиленовым синим. При этом гемсодержащая поверхность окрашивалась в коричнево-черный цвет на синеватом фоне интактной слизистой.
Учитывали распределение животных в группе с дефектами слизистой оболочки по степени выраженности макроскопических изменений, проводили расчёт индекса Паулса (ИП) по формуле: (среднее количество язв х % животных с язвами)/100 % и гастропротекторную активность (ГА): отношение ИП в контрольной группе к ИП в опытной группе. Изучаемый препарат считали активным, если ГА составляла 2 и более единиц. Биохимически оценивали в 10 % гомогенатах СОЖ уровень малонового диальдегида (МДА), глутатиона и активность миелопероксидазы (МПО) общепринятыми методами [12 – 14]. Для проведения гистологического исследования участки стенки желудка фиксировали в 10 % растворе формалина через 2 ч после взятия образцов и полного расслабления гладкой мускулатуры. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином. Микроскопическое изучение препаратов стенки желудка проводили на микроскопе B-350 (“Optika”, Италия).
Статистическую обработку проводили с помощью программ Excel и Statistica 6.0. Результаты в таблицах представляли в виде M + а. Различия между группами оценивали с помощью критериев непараметрических методов анализа вариаций в соответствии с инструкциями к программам обработки данных и считали значимыми при р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Для EW и мелатонина ранее было показано наличие стресс-протекторных свойств [5 – 7]. В связи с этим на первом этапе эксперимента была исследована их гастропротекторная активность на модели стрессорной язвы по Селье. После иммобилизации животных на холоде в слизистой желудка происходили следующие патологические изменения: развитие гиперемии, парез и дилатация мышц гастрии, образование эрозий и язв, рефлюкс желчи и фибринозный налет.
EW, мелатонин и препарат сравнения мизопростол при профилактическом введении проявляли гастропротекторную активность, выраженную в различной степени. Результаты представлены в табл. 1.
Таблица 1. Влияние EW и мелатонина на язвообразование при стрессе по Селье (n = 10)
Примечание. * — отличия значимы по сравнению с контролем приp < 0,05; ** — позитивные отличия значимы по сравнению с мизопростолом при p < 0,05. М — мелатонин; К — крупные язвы, С — средние язвы, М — мелкие язвы; ИП — индекс Паулса, ГА — гастропротекторная активность.
При однократном введении мелатонин обладал умеренной гастропротекторной активностью (3 мг/кг; ГА = 2). Он обеспечивал снижение числа язвенных дефектов СОЖ среднего (в 2 раза) и малого (в 1,9 раза) размеров. Отмечена дозовая зависимость гастропротекторного действия мелатонина. Однако по действию мелатонин существенно уступал активности мизопростола. EW при однократном введении крысам не обладал гастропротекторной активностью и не снижал числа животных с язвенными дефектами.
Семидневный профилактический курс мелатонина оказывал достаточное гастропротекторное действие (ГА = 3), немного отличающееся от такового при однократном введении этого гормона. В дозе 3 мг/кг мелатонин уменьшал число деструкций СОЖ: крупные язвы практически отсутствовали, а число средних и мелких было существенно ниже, чем в контрольной группе животных. Полученные данные подтверждают роль мелатонина в развитии и ограничении стресс-реакции и соматической патологии [5, 15].
Анализ полученных данных показал, что профилактическое введение EW крысам в течение недели до стресса оказывало гастропротекторное действие, сопоставимое с действием мизопростола, а при введении в дозе 1 мкг/кг — превосходящее таковое. EW обладал
максимальной гастропротекторной активностью (в дозе 0,1 мкг/кг ГА = 27; в дозе 1 мкг/кг ГА = 50), превосходя эффекты мизопростола и мелатонина. Выявленные гастропротекторные свойства EW, отличающиеся от таковых у мелатонина, а также тот факт, что при однократном введении для EW не была выявлена гастропротекторная активность, свидетельствуют об участии иммунной и антиоксидантной системы в реализации гастропротекторного действия этого пептида при многократном применении.
В связи с выявленной выраженной гастропротекторной активностью EW при профилактическом применении в следующей серии было проведено расширенное изучение эффективности этого дипептида и его модифицированных аналогов при лечебном применении на модели индометациновой язвы желудка.
Установлено, что моделирование язвы желудка путем введения индометацина в упьцерогенной дозе сопровождается развитием значимых патологических изменений у крыс через 3-е суток от момента затравки. На 7-е сутки животные теряли до 30 % массы тела от фоновых значений, что было связано как с потерей крови в результате желудочных кровотечений, так и с активизацией катаболизма. У всех животных из контрольной группы отмечали выраженную гиперемию и появление деструкций в слизистой оболочке желудка: значительное количество поверхностных и глубоких эрозий и отек околоэрозивной поверхности. На дне большинства деструкций выявлено наличие гем-положительного материала (кровь: гематин и метгемоглобин вследствие кровоизлияния обнаженных подслизистых капилляров и окисления гемоглобина соляной кислотой желудочного сока). Значимое снижение мас
сы тела отмечали в следующих случаях использования препаратов: в контроле, при введении EW и nEW в дозе 10 мкг/кг — у 100 % животных в группе. Наибольшим протекторным действием обладал ivEW в дозе 0,1 мкг/кг; EW и nEW, вводившиеся дозе 0,1 мкг/кг, по этому показателю были сопоставимы. На фоне введения сукралфата происходило существенное снижение, как числа, так и площади язвенных дефектов. Гиперемия слизистой была отмечена у 40 % животных.
Результаты оценки влияния изучаемых препаратов на количество деструкций в слизистой оболочке желудка животных представлены в табл. 2.
Таблица 2. Влияние модифицированных аналогов EW на процесс язвообразования у животных на модели индометациновой язвы желудка (n = 12)
Примечание. * — отличия значимы по сравнению с контролем при p < 0,05; ** — позитивные отличия значимы по сравнению с сукралфатом при p < 0,05. М — мелатонин; К — крупные язвы, С — средние язвы, М — мелкие язвы; ИП — индекс Паулса, ГА — гастропротекторная активность.
Введение EW в различных дозах в желудок препятствовало образованию язв желудка. Этот эффект в большей мере был выражен на фоне введения в дозе 0,1 мкг/кг как по общему числу язв желудка, так и по количеству крыс с язвами. В дозе 10 мкг/кг препарат достоверно уменьшал число крупных деструкций и не оказал влияния на число средних и мелких язв. Мелатонин по эффективности приближался к EW, но менее существенно.
Выраженными гастропротекторными свойствами обладал пептид ivEW. На фоне его введения происходило уменьшение индекса Паулса по сравнению с контролем и препаратом сравнения (р < 0,05). В дозе 10 мкг/кг он сопоставим с активностью EW по уменьшению среднего числа деструкций, а по гастропротекторной активности превосходил действие сукралфата и других препаратов. Пептид nEW, который был сопоставим по ряду показателей с EW, превосходил по ГА сукралфат.
Содержание в СОЖ продуктов перекисного окисления и активность миелопероксидазы на фоне терапии пептидами существенно уменьшались, а уровень глутатиона увеличивался. Установленные позитивные сдвиги в отношении биохимических показателей функционирования СОЖ под влиянием экспериментальной терапии препаратами характеризуют вклад антиоксидантной системы в реализацию гастропротекторных свойств выбранных соединений [6, 7]. Результаты представлены в табл. 3.
Таблица 3. Влияние модифицированных аналогов EW на биохимические показатели слизистой оболочки желудка при язвообразовании у животных на модели индометациновой язвы желудка (n = 12)
Примечание. л — отличия значимы по сравнению с группой интактных крыс при p < 0,05; * — отличия значимы по сравнению с контролем при p < 0,05; ** — позитивные отличия значимы по сравнению с сукралфатом при p < 0,05. М — мелатонин; МДА — малоновый диальдегид, МПО — миелопероксидаза
В контроле происходило значимое увеличение уровня МДА в 2,9 раза, активность миелопероксидазы увеличивалась в 1,9 раза, а уровень глутатиона падал в 2,1 раза по сравнению с интакными крысами (р < 0,05). Это свидетельствовало об ускорении процессов свободнорадикального окисления и истощения пула антиоксидантов (за счет ингибирования синтеза протекторных факторов), а также притоке полиморф
ноядерных лейкоцитов, активированных хлоридной средой, что приводило к увеличению активности миелопероксидазы.
Сукралфат снижал уровень продуктов ПОЛ в 1,6 раза по сравнению с контролем, активность МПО — в 1,5 раза, восстанавливал сниженную концентрацию глутатиона в 1,3 раза в основном за счет связывания и процессов адсорбции на поверхности СОЖ. EW по активности приближался к сукралфату: на фоне его введения уровень МДА снижался в 2,2 раза (0,1 мкг/кг), по влиянию на МПО и уровень глутатиона был сопоставим с сукралфатом (0,1 мкг/кг). Однако это происходило, вероятно, по другому механизму, отличному от действия препарата сравнения. В дозе 10 мкг/кг EW несколько уступал действию сукралфата.
Наибольшие позитивные сдвиги отмечали у крыс, получавших пептид ivEW. Так, при его введении в дозе 0,1 мкг/кг отмечали значимую нормализацию процессов ПОЛ и активности миелопероксидазы, восстановление уровня глутатиона (р < 0,05). Но содержание глутатиона в гомогенате СОЖ не достигало значений интактных животных. По активности пептид ivEW существенно превосходил EW, nEW, мелатонин и сукралфат.
При микроскопии окрашенных срезов стенки желудков крыс были выявлены патологические изменения в слизистой оболочке. В контроле отмечали наличие глубоких язвенных дефектов с обнажением мышечной пластинки, неглубоких язв (до железистого эпителия), множество поверхностных эрозий. У животных, получавших сукралфат, отмечали отсутствие глубоких язвенных дефектов и незначительное число поверхностных эрозий. Терапия мелатонином приводила к уменьшению числа язвенных дефектов, однако по глубине эти язвы были похожи на таковые, выявленные в контрольной группе. EW оказывал более значимое позитивное влияние на процессы повреждения СОЖ, чем мелатонин. В группах крыс, получавших терапию пептидами ivEW и nEW, зарегистрированы минимальные патологические изменения СОЖ в основном за счет поверхностных эрозий и мелкоточечных участков некроза эпителия.
По величине гастропротекторной активности на модели индометациновой язвы желудка при лечебной схеме введения изучаемые вещества можно расположить в следующий ряд в порядке от наиболее активного соединения к менее активному: ivEW > nEW > EW « мелатонин.
ВЫВОДЫ
- Дипептид глутамил-триптофан не оказывает гастропротекторного действия при однократном профилактическом применении на модели стрессорной язвы. При семикратном профилактическом введении крысам EWвызывает значимое снижение числа язвенных деструкций в желудке крыс, подвергнутых иммобилизационному стрессу по Селье, чем существенно отличается от мелатонина.
- Глутамил-триптофан, изовалероил-глутамил-триптофан, никотиноил-глутамил-триптофан и мелатонин оказывают гастропротекторное действие, выраженное в разной степени на модели индометациновой язвы желудка у крыс.
- Изовалероил-глутамил-триптофан обладает наибольшей гастропротекторной активностью в условиях приема ингибитора циклооксигеназы по сравнению с другими препаратами. На фоне экспериментальной терапии пептидом отмечается существенное увеличение содержания антиоксидантов, снижение интенсивности процессов липопероксидации в слизистой оболочке желудка.
Литература:
- В. Г. Подопригорова, Оксидативный стресс и язвенная болезнь, Москва (2004).
- Регистр лекарственных средств России, Энциклопедия лекарств — 12-й вып., Москва (2005).
- В. Н. Шаталов, Д. Б. Корман, Т. В. Крутова и др., Фармакол. и токсикол., 3, 60 – 63 (1988).
- Е. Е. Лесиовская, Метапрот при экстремальных воздействиях, СПб. (2010).
- Т. В. Кветная, И. В. Князькин, Мелатонин: роль и значение в возрастной патологии, ВМедА, СПб (2003).
- RU2213571, 30.11.2001, с. 6, левый столбец О. В. Филиппова, Д. В. Золотарев, Е. Л. Карпова, Антигипоксическое средство (тимоген) (2001).
- Клиническая фармакология тимогена, В. С. Смирнов (ред.), СПб. (2003).
- Public Health Service on Human Care and Use of Laboratory Animals. Washington. — D. C.: U. S. Department of Health and Human Services, 28 (1996).
- Report of the AVMA panel on euthanasia, American Veterinary Medical Association, 202(2), 229 – 249 (1993).
- G. Derelanko, G. T. Long, Digestive Diseases and Science, 25(11), 830-838 (1980).
- Ф. П. Тринус, H. А. Мохорт, Б. М. Клебанов, Нестероидные противовоспалительные средства, Здоровья, Киев (1975).
- Медицинские лабораторные технологии. Справочник, А. И. Карпищенко (ред.), Интермедика, Санкт-Петербург (2002).
- Aykac, M. Uysal, A. S. Yalcin, et al., Toxicology, 36, 71 – 76 (1985).
- P. Bradley, D. A. Priebat, R. D. Christerser, G. Rothstein, J. Invest. Dermatol., 78, 206 – 109 (1982).
- Melchiorri, E. Sewerynek, R. J. Reiter, et al., Br. J. Pharmacol., 121, 264 – 70 (1997).
Скачать PDF
Назад к списку