После осознания целесообразности создания единой лекарственной формы, объединяющей все три препарата, возникла необходимость изучения противовирусной активности создаваемого комплекса. С этой целью были проведены экспериментальные исследования комплексного применения бендазола, тимогена натрия и аскорбиновой кислоты при разных режимах дозирования. Исходный препарат для изучения представлял собой смесь трех веществ в соотношении (бендазол:тимоген натрий:аскорбиновая кислота равном 20:0,5:50). Указанные соединения смешивали в сухом виде, исследуемый препарат получали путем тщательного перетирания в агатовой ступке. Исследования, выполненные методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, показали, что все компоненты комплекса при таком методе приготовления равномерно смешивались между собой. Для последующего исследования препарат растворяли в изотоническом растворе хлорида натрия, а для перорального введения — в дистиллированной воде. Во всех экспериментах в качестве контроля использовали растворитель.

На первом этапе исследовали защитные свойства Цитовира-3® на модели экспериментальной гриппозной инфекции. Исследования проводили на мышах, у которых воспроизводили экспериментальную инфекцию путем интраназального заражения животных вирусом гриппа типа А(H3N2) штамм Виктория/72. Цитовир-3® вводили однократно перорально за 24 и 48 час до заражения (табл. 3).

Таблица 3. Защитная эффективность Цитовира-3® при однократном применении до заражения вирусом гриппа

Группа животных	Доза препарата, мг/кг	Срок введения, час	Количество животных	Выживаемость, %	СГПЖ, сут.
Цитовир-3®	5,3	48	10	70(35-93)	116,3
Цитовир-3®	5,3	24	10	80(44-98)*	133,3
Цитовир-3®	16,0	48	10	60(26-83)	114,9
Цитовир-3®	16,0	24	10	80(44-98)*	114,9
Контроль	-	-	10	30(7-65)	78,1

Примечание. Срок введения — время до момента заражения вирусом. СГПЖ – средняя гармоническая продолжительности жизни животных в группе. Цитовир-3® — животные, получавшие перорально раствор Цитовира-3® в дистиллированное воде. Контроль – животные, перорально получавшие аликвотное количество дистиллированной воды. Звездочкой отмечены достоверные различия с показателями контроля при р<0,05.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что Цитовир-3® при однократном пероральном применении за 24 и 48 час до заражения оказывает отчетливое защитное действие в отношении экспериментальной гриппозной инфекции. В случае однократного введения препарата за 48 час до заражения, выживаемость инфицированных мышей, по сравнению с контролем, увеличивалась на 30-40% и, в зависимости от использованной дозы препарата, составила 60-70%. Укорочение интервала между введением Цитовира-3® и последующим заражением животных вирулентной культурой до 24 час несколько повышало выживаемость инфицированных мышей. При этом, однако, доза препарата заметного влияния на его протективную активность не оказывала. Выживаемость инфицированных мышей, по сравнению с контролем возросла на 50% и составила 80%. Средняя гармоническая продолжительности жизни зараженных животных (СГПЖ) корреспондировала с процентом выживаемости. При этом максимальное значение СГПЖ отмечено при введении 5,3 мкг/кг Цитовира-3® за 24 часа. до заражения вирулентной культурой вируса.

В другой серии экспериментов оценивали лечебную эффективность Цитовира-3® при его применении в разные сроки после заражения (табл. 4).

Таблица 4. Защитная эффективность препарата Цитовир-3® при его применении после заражения

Группа животных	Доза препарата, мг/кг	Схема введения	Количество животных	Выживаемость, %	СГПЖ, сут.
Цитовир-3®	5,3	Схема 1	10	30(7-65)	79,4
Цитовир-3®	5,3	Схема 2	10	50(19-81)	105,3
Цитовир-3®	5,3	Схема 3	10	30(7-65)	81,9
Цитовир-3®	5,3	Схема 4	10	20(2-56)	75,8
Цитовир-3®	5,3	Схема 5	10	60(26-83)	119,1
Цитовир-3®	16	Схама 1	10	60(26-83)	81,3
Цитовир-3®	16	Схама 2	10	100(69-100)*	149,3
Цитовир-3®	16	Схама 3	10	60(26-83)	75,8
Цитовир-3®	16	Схама 4	10	80(44-98)*	111,1
Цитовир-3®	16	Схама 5	10	70(35-93)	138,9
Контроль	-	-	10	30(7-65)	78,1

Примечания. Схемы введения препарата:
схема 1 — через 24 час после заражения;
схема 2 – через 48 час после заражения;
схема 3 — через 72 час после заражения;
схема 4 — через 24 и 48 час после заражения;
схема 5 — через 24, 48 и 73 час после заражения.
Цитовир-3® — животные, получавшие перорально раствор Цитовира-3® в дистиллированной воде. Контроль – животные, перорально получавшие аликвотное количество дистиллированной воды. СГПЖ — средняя гармоническая продолжительности жизни животных в группе. Звездочкой отмечены достоверные различия с контролем при p<0,05.

Проведенные исследования показали, что применение Цитовира-3® после заражения также способствовало повышению выживаемости мышей, инфицированных вирулентной культурой вируса гриппа А. Вместе с тем, выраженность наблюдавшегося эффекта в значительной степени зависела от дозы препарата и схемы его применения. Так, применение Цитовира-3® в дозе 5,5 мг/кг сопровождалось развитием максимального защитного эффекта только в случае введения через 24, 48 и 72 часа после заражения (схема 5). Выживаемость животных составила 60% против 30% в контроле, значение СГПЖ составило 119,1. Более выраженное защитное действие отмечалось при трехкратном увеличении вводимой дозы препарата. Так, если Цитовир-3® применяли через 48 час после заражения (схема 2), то выживали все животные группы, в то время как 70% контрольных мышей погибало; показатель СГПЖ в опытной группе достигал максимального значения и почти в 2 раза превышал значение показателя в контроле. Другие схемы введения препарата также обеспечивали достоверно высокий уровень защиты, превосходивший таковой в контроле в среднем на 30-50%.

Суммируя результаты двух серий экспериментов, необходимо отметить, что Цитовир-3® в испытанных дозах обладает отчетливым проективным действием при введении как до, так и после заражения мышей вирулентным штаммом вируса гриппа типа А.

Результаты исследований механизма действия комплекса из 3 препаратов: бендазола, тимогена и аскорбиновой кислоты, показали, что одним из возможных механизмов действия может быть стимуляция синтеза эндогенного интерферона. Для проверки этой гипотезы Цитовир-3® вводили мышам перорально в дозе 5,3 и 16 мг/кг массы в объеме 0,1 мл. Через 2, 4, 6, 24 и 48 час после введения у животных отбирали пробы крови из ретробульбарного венозного сплетения, получали из нее сыворотку, в которой определяли титр сывороточного интерферона (рис. 1).

Рис. 1. Динамика накопления интерферона в крови мышей в ответ на пероральное введение Цитовира-3® в дозах 5,3 мг/кг(1) и 16 мг/кг (2).

По оси ординат — концентрация эндогенного интерферона, ед./мл; по оси абсцисс – время после введения препарата, час.
Горизонтальной линией отмечена концентрация эндогенного интерферона в крови интактных мышей

Полученные результаты свидетельствуют о том, что введение Цитовира-3® стимулирует продукцию эндогенного интерферона в статистически достоверных концентрациях. При этом динамика его выработки зависела от вводимой дозы. Для дозы 5.3 мг/кг была характерна динамика с максимумом на 4 час после введения. У животных, получавших 16 мг/кг, этот максимум отмечался через 24 час после введения Цитовира-3®. Вместе с тем, оценивая прямой противовирусный эффект Цитовира-3® (табл. 3 и 4) и динамику накопления интерферона (рис. 1), вряд ли можно отнести достигаемый эффект только на счет интерфероногенных свойств препарата. Вероятнее всего, протективное действие было обусловлено увеличением общей резистентности организма, в том числе и факторов неспецифической защиты. В правомерности этой гипотезы убеждают результаты определения в сыворотке крови мышей содержания лизоцима, миелопероксидазы и неспецифической эстеразы (табл. 5).

Таблица 5. Влияние Цитовира-3® на содержание некоторых сывороточных факторов неспецифической защиты

Препарат	Доза, мг/кг	Срок исследования, сут.	Концентрация в сыворотке крови
Препарат	Доза, мг/кг	Срок исследования, сут.	лизоцима, мкг/мл	НЭ, отн.ед.	МП, отн.ед.
Цитовир-3®	5,3	1	1,44±0,52*	0,84±0,26*	0,98±0,21*
		3	1,76±1,02*	1,12±0,38*	1,34±0,14*
		5	1,70±1,11*	0,76±0,21*	1,18±0,35*
		7	1,63±1,06	0,42±0,17	0,54±0,20
		14	0,75±0,25	0,36±0,13	0,52±0,29
Цитовир-3®	16	1	2,06±0,99*	1,34±0,38*	1,64±0,45*
		3	3,12±1,11*	2,12±0,65*	2,98±0,75*
		5	2,89±1,06*	1,64±0,35	2,64+0,55*
		7	2,41±0,78*	0,89±0,15*	1,69±0,25*
		14	0,98±0,42	0,64±0,12	0,53±0,18
Контроль	-	1	0,61±0,11	0,34±0,15	0,41±0,21
		3	0,76±0,16	0,42±0,18	0,52±0,29
		5	0,44±0,18	0,32±0,09	0,38±0,13
		7	0,56±0,26	0,39±0,06	0,69±0,25
		14	0,76±0,32	0,33±0,12	0,53±0,18

Примечание. НЭ — неспецифическая нафтол-AS-ацетат эстераза; МП — миелопероксидаза. Звездочкой отмечены достоверные различия с контролем, p>0,05.

Полученные результаты в целом подтверждают гипотезу о множественности иммуномодулирующих эффектов Цитовира-3®. Так, в ответ на введение препарата в дозе 5,3 мг/кг отмечалось достоверное увеличение концентрации лизоцима уже к исходу 1-х сут. максимальный эффект отмечался на 3-и сут. и только после 5-х сут. отмечалось постепенное снижение содержания лизоцима в сыворотке крови животных.

Аналогичная динамика наблюдалась и в отношении двух других факторов неспецифической защиты. Увеличение дозы Цитовира-3® в 3 раза до 16 мг/кг сопровождалось более выраженной стимуляцией выработки исследованных ферментов как по концентрации, так и по продолжительности эффекта.

Подводя итоги циклу экспериментальных исследований противовирусной эффективности Цитовира-3®, следует отметить, что объединение трех препаратов в одну лекарственную форму абсолютно оправдано. Созданное комплексное лекарственное средство обладает целым рядом положительных эффектов, обеспечивающих его высокую клиническую эффективность в наблюдениях на людях.