Влияние иммунотропной наружной терапии на экспрессию генов цитокинов в коже и периферической крови больных атопическим дерматитом

Цель. Изучить клиническую эффективность наружной иммунотропной терапии кремом Тимоген® 0,05% и ее влияние на некоторые иммунологические параметры в коже и крови больных атопическим дерма­титом (АтД).

Материалы и методы. В исследование включены 40 человек, которые разделены на основную (больные АтД, n=20) и контрольную группы (здоровые доноры, n=20). Всем больным АтД проведен непрерыв­ный курс лечения кремом Тимоген® 0,05% в течение 14 дней. Пациенты наносили препарат на все пора­женные участки кожи 2 раза в день тонким слоем. Клиническую эффективность лечения оценивали по изменению следующих параметров: исследовательской глобальной оценки, субъективной оценки ин­тенсивности зуда и сухости кожи по отношению к исследуемому участку кожи. Материалом для имму­нологического исследования служили образцы кожных биоптатов и периферическая кровь больных АтД и здоровых доноров. Экспрессию генов цитокинов в коже и периферической крови больных АтД опре­деляли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.

Результаты исследования. На фоне терапии кремом Тимоген® 0,05% в течение 14 дней у всех больных АтД отмечен положительный клинический эффект: уменьшение сухости, высыпаний, интенсивности зуда кожи. При иммунологическом исследовании показателей экспрессии генов цитокинов в коже до и после лечения кремом Тимоген® 0,05% выявлено достоверное увеличение уровня экспрессии гена цито­кина интерлейкина-7 (ИЛ-7), уменьшение экспрессии генов цитокинов ИЛ-8, ИЛ-5 (p<0,05). В перифе­рической крови больных АтД до и после лечения кремом Тимоген® 0,05% в сравнении со здоровыми доно­рами достоверных различий в показателях экспрессии генов цитокинов не выявлено.

Заключение. Крем Тимоген® 0,05 % обладает местной иммунотропной активностью, влияет на интенсив­ность воспаления и приводит к клиническому улучшению состояния больных АтД. Изменений иммун­ных показателей в крови в процессе исследования не выявлено.

Введение

Атопический дерматит (АтД) — аллергическое заболевание кожи, возникающее, как правило, в раннем детском возрасте у лиц с наследственной предрасположенностью к атопическим заболевани­ям, имеющее хроническое рецидивирующее тече­ние, возрастные особенности локализации и мор­фологии очагов воспаления, характеризующееся кожным зудом и обусловленное гиперчувствитель­ностью как к аллергенам, так и к неспецифичес­ким раздражителям [1].

Кожа является высокоорганизованным органом иммунной системы и обладает необходимым соста­вом иммунокомпетентных клеток, взаимодейству­ющих с помощью поверхностных рецепторных структур и цитокинов [2]. В коже выявлено боль­шое количество различных субпопуляций Т-лим- фоцитов, которые вместе с системой региональных лимфатических узлов осуществляют функцию ме­стного адаптивного иммунитета. Кроме того, в коже содержится большое количество вспомогательных клеток, таких как дендритные клетки Лангерганса, макрофаги, тучные клетки, которые осуществляют антигенпрезентирующую и фагоцитирующую фун­кции [3]. Большинство из этих клеток имеют мие- лоидное происхождение. На поверхности иммуно­компетентных клеток представлено большое коли­чество разнообразных мембранных структур, отве­чающих за осуществление их основных функций. Основным типом антигенпрезентирующих клеток (АПК) являются дендритные клетки Лангерганса.

Функцию этих клеток могут также выполнять мак­рофаги, тучные клетки. Так, на поверхности АПК содержатся продукты генов гистосовместимости 1- и 2-го классов (МНС I, II), посредством кото­рых осуществляется представление антигенных пептидов Т-клеткам. На поверхности большинства клеток представлены рецепторы для Fc-фрагмен­тов IgG, IgA, IgE, IgM. Взаимодействие иммуногло­булинов с соответствующими рецепторами приво­дит к активации клеток с последующим синтезом ряда цитокинов. Значительную группу мембранных структур макрофагов, дендритных и тучных клеток образуют рецепторы для компонентов комплемен­та, а также молекулы адгезии. Эти рецепторы пред­назначены для распознавания иммунных комплек­сов, осуществления фагоцитоза и регуляции им­мунных процессов [4].

Известно, что стромальные клетки (эпителио- циты, фибробласты, эндотелиоциты кожных капил­ляров) могут также вовлекаться в осуществление иммунного ответа. Так, под влиянием цитокинов, активированных дендритных клеток, макрофагов и Т-лимфоцитов стромальные клетки приобретают некоторые новые свойства, в частности способность осуществлять эндоцитоз и переваривание патоге­нов, экспрессировать молекулы адгезии, продуци­ровать целый ряд цитокинов и хемокинов [5].

Среди механизмов развития АтД ведущее значе­ние придается иммунным нарушениям [6, 7]. Услов­но иммунный ответ при АтД можно разделить на 2 фазы: острую и хроническую, или раннюю и по­зднюю [8]. В патогенезе АтД в разное или в одно и то же время принимают участие цитокины с проти­воположным действием, продуцируемые антагони­стическими популяциями Th1- и Th2-лимфоцитов.

При остром воспалении, т. е. в раннюю фазу раз­вития АтД, наблюдается преобладание активности ^2-ответа. Выделяют разные причины, обуслов­ливающие сдвиг иммунологических реакций в сто­рону ^2-звена. Прежде всего следует отметить на­следственные факторы. Известно около 20 генов, ассоциируемых с атопической предрасположенно­стью. Особый интерес заслуживает область на 5-й хромосоме (5q31-33), содержащая кластер генов ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-13 и гранулоцитарно-мак- рофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ). Установлены ассоциации аллергичес­ких заболеваний с маркерами ИЛ-4 этого класте­ра, полиморфизм по промотору ИЛ-4 связан с вы­соким содержанием IgE. Местные факторы, обус­ловливающие дифференцировку ThO-клеток в Th2, включают цитокиновое окружение, тип антигена и костимуляции, воздействие разных гуморальных компонентов.

Для ^2-ответа характерен высокий уровень цитокинов ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-13, а также общего IgE. Однако при этом отмечается сниженная продукция у-интерферона (ИНФ-у). ИЛ-4 подавляет продук­цию ИНФ-у и иммунный ответ по ТЫ-типу, спо­собствует синтезу IgE. Кроме того, он стимулирует экспрессию сосудистых молекул адгезии 1, кото­рые обеспечивают миграцию эозинофилов и моно­цитов в очаг воспаления, т. е. клеточную инфильт­рацию, характерную для развития поздней фазы аллергической реакции. По данным других авторов, при АтД с помощью иммуногистохимического ис­следования в коже выявлено преобладание эксп­рессии хемокина-CLA (кожный лимфоцитарный антиген) на поверхности Th-2 [9—11].

ИЛ-5 главным образом стимулирует дифферен- цировку и эндотелиальную адгезию эозинофилов [12]. В зоне острого воспаления количество тучных клеток нормальное, однако они находятся на раз­ных стадиях дегрануляции, что свидетельствует об активности текущего процесса.

Вследствие постоянного воздействия экзоген­ных факторов, хронического повреждения кожных покровов (зуд, расчесывание), высвобождения внутриклеточных белков, которые действуют как аутоантигены, воспалительный процесс приобре­тает хроническое течение, для которого характер­но преобладание активности ТЫ-ответа, повыше­ние синтеза ИЛ-12 макрофагами и эозинофилами, повышение уровня ИЛ-5, ИЛ-8 и ИФН-у, которые являются маркерами хронического воспаления в коже, а при длительном аллергическом процессе — также ИЛ-3 и ГМ-КСФ [12].

При хронической стадии доминирует актива­ция макрофагов и эозинофилов, которые проду­цируют ИЛ-12. Доказано, что рецептор к ИЛ-12 экспрессируется только на ТЫ-клетках, но не на ^2-клетках [13].

В очагах хронического воспаления количество тучных клеток возрастает. Они способны синтези­ровать и секретировать ИЛ-4, инициирующий диф­ференцировку и пролиферацию ^2-лимфоцитов.

Выявленный дисбаланс между субклассами Т-хел- перов и установление его роли в развитии пораже­ния кожи при АтД изменили представление о ди­агностическом значении повышения числа Т-хел- перов и иммунорегуляторного индекса (Т-хелперы/ Т-супрессоры). Иммунопатогенез АтД характери­зуется прежде всего не количеством Т-хелперов и Т-супрессоров, а изменением дифференцирования Т-лимфоцитов (Th0) и профиля их цитокиновой секреции [14].

Кроме особенностей системной реакции имму­нитета, существенное патогенетическое значение имеет оценка состояния иммунокомпетентных структур кожи и обусловленных ими патогистоло­гических изменений в эпидермисе и дерме. Гисто­логические изменения при АтД также зависят от степени остроты процесса и длительности повреж­дения кожи. Обычно при гистологическом иссле­довании кожи в острой стадии АтД в эпидермисе выявляют различной степени выраженности гипер­кератоз, спонгиоз, внутриклеточный отек керати- ноцитов и умеренную гиперплазию эпидермиса, в дерме — периваскулярные инфильтраты различной степени плотности, расширение сосудов поверхно­стной сети, отек эндотелия капилляров и в меньшей степени — его гиперплазию. Дермальный инфильт­рат в острой стадии состоит преимущественно из лимфоцитов с небольшим количеством гистиоци­тов (дермальных макрофагов), эозинофильные и нейтрофильные лейкоциты встречаются редко. Тучные клетки обычно обнаруживаются в различ­ных стадиях дегрануляции. Однако данные о состо­янии этой клеточной популяции в коже при АтД малочисленны. Найдено некоторое снижение их числа в кожном биоптате при тяжелом течении за­болевания, что связывают с активацией дегрануля­ции и разрушением клеток [15]. В хронической ста­дии болезни более выражены гиперкератоз и гипер­плазия эпидермиса, межклеточный отек отсутству­ет или минимален, количество эпидермальных клеток Лангерганса повышено, а гистиоциты доми­нируют в дерме, где также увеличивается количе­ство эозинофильных лейкоцитов [16].

Патогенетическое лечение АтД должно действо­вать на все звенья патологического процесса, ле­жащего в основе заболевания, и предполагает ком­плекс мероприятий, направленных на устранение контакта с виновным аллергеном и триггерными факторами, ступенчатый подход к наружной тера­пии, фармакотерапию, а также аллерген-специфи- ческую иммунотерапию. Наружная терапия явля­ется важнейшей составной частью лечения больных АтД и направлена на купирование проявлений кож­ного воспаления, устранение зуда, восстановление поврежденного эпителия и улучшение барьерных функций кожи. Большинство существующих на сегодняшний день схем наружной терапии основа­но на принципе использования топических ГКС в период обострения заболевания АтД и использова­ния средств по уходу за кожей в период ремиссии заболевания [17]. В последнее время все чаще вы­являются случаи тяжелого течения АтД, резистен­тного к традиционной наружной терапии, отмеча­ется увеличение потребности в ГКС, длительное применение которых в ряде случаев является не­обходимым. Однако имеются существенные со­мнения в полной безопасности их применения, в особенности длительного, ввиду нежелательных побочных эффектов, в первую очередь местных: атрофия кожи, появление телеангиоэктазий, гипо­пигментации, акне, а также системных эффектов: угнетение гипоталамо-гипофизарно-надпочечни- ковой системы, повышение риска развития глау­комы, катаракты и синдрома Кушинга. В этой свя­зи актуальной является проблема поиска альтер­нативных методов наружной терапии АтД. Это об­стоятельство обосновывает включение в комплек­сную терапию АтД иммунотропных препаратов, оказывающих воздействие на иммунное воспале­ние в коже. В качестве такого средства может быть использован пептидный тимомиметик крем тимо- ген 0,05 % (альфа-глутамил-триптофан).

Ранее проведенные исследования установили модулирующее действие крема Тимоген® на продук­цию цитокинов. Так, исходно повышенный уро­вень цитокинов ИЛ-1а, ИЛ-8 и фактора некроза опухоли а (ФНОа) в крови снижался под влияни­ем Тимогена^®, в то время как при относительно низ­ком исходном содержании этих цитокинов их кон­центрация в крови возрастала. Также выявлено его стимулирующее влияние на дифференцировку Т-лимфоцитов, опосредующих гиперчувствитель­ность замедленного типа, усиление эффекторной активности Т-лимфоцитов в реакциях трансплан­тационного иммунитета [18].

Поскольку при АтД кожа является органом-ми­шенью аллергического воспаления, углубленное изучение именно локального иммунного ответа может оказаться наиболее информативным и по­зволит определить иммунные маркеры активности воспаления на разных стадиях заболевания и выя­вить критерии эффективности проводимой тера­пии, в особенности наружными препаратами.

Целью исследования явилось изучение клини­ческой эффективности наружной иммунотропной терапии кремом Тимоген® 0,05% и ее влияние на не­которые иммунологические параметры в коже и крови больных АтД.

Материалы и методы исследования

В исследование включены 40 человек, из них 23 женщины в возрасте от 17 до 50 лет и 17 мужчин в возрасте от 20 до 32 лет.

Группу больных АтД составили 20 человек в воз­расте от 16 до 48 лет. Диагноз АтД был установлен согласно критериям Hanifin и Rajka [19], модифи­цированным отечественными авторами и отражен­ным в Российском национальном согласительном документе по АтД [1]. У 16 пациентов (80%) дебют АтД отмечался в возрасте до 2 лет, при этом дли­тельность заболевания составляла от 15 до 48 лет, частота обострений составляла от 3 до 5 раз в год, у 9 (45%) больных заболевание носило торпидный характер с кратковременными периодами улучше­ния длительностью до 1 мес. При поступлении все больные АтД находились в фазе обострения основ­ного заболевания. Всем пациентам было проведе­но клинико-лабораторное аллергологическое и иммунологическое обследование.

Группу контроля составили 20 человек (практи­чески здоровые лица без признаков атопии в воз­расте от 19 до 32 лет).

Всем больным АтД проведено лечение обостре­ния АтД: антигистаминная терапия, местная увлаж­няющая терапия, непрерывный курс лечения кре­мом Тимоген® 0,05% в течение 14 дней. На протяже­нии всего периода исследования больные АтД не получали ни системные, ни топические ГКС. Па­циенты наносили препарат на все пораженные участки кожи 2 раза в день тонким слоем. Эффек­тивность терапии кремом Тимоген® 0,05% оценива­ли на ограниченном участке пораженной кожи вер­хних или нижних конечностей размером 10×10 см.

Материалом для исследования служили образ­цы кожных биоптатов, взятые методом пункцион­ной биопсии, и периферическая кровь больных АтД и здоровых доноров. Забор материала у больных АтД проводили до лечения в период обострения и на 14-й день лечения кремом Тимоген® 0,05%, а у здоровых доноров однократно.

Пункционную биопсию производили в асепти­ческих условиях с помощью одноразового стериль­ного пробойника диаметром 3 мм (Stumpp Medizin- technik GmbH, Германия) под местной анестезией 2% раствором лидокаина гидрохлорида. Экспрес­сию генов цитокинов в коже и периферической крови больных АтД определяли методом полиме­разной цепной реакции в реальном времени. Для выделения клеток из периферической крови и кожи использовали твердотельный термостат «Термит» производства компании «ДНК-Технологии» (Рос­сия). Для постановки обратной транскрипции ис­пользовали твердотельный термостат «Гном» про­изводства компании «ДНК-Технологии» (Россия). Постановку полимеразной цепной реакции в реаль­ном времени проводили на детектирующем термо­циклере «ДТ-96» «ДНК-Технологии» (Россия). Учет результатов реакции осуществляется автоматически с помощью программного обеспечения, поставля­емого с детектирующим амплификатором. В био­логических образцах, содержащих мРНК иссле­дуемого цитокина, программа фиксирует положи­тельный результат и определяет значение индика­торного цикла (Ср). Уровень экспрессии исследуе­мого цитокина измеряли в относительных единицах.

Проводили оценку экспрессии генов в клетках кожи и периферической крови следующих цитоки­нов: ИЛ-1Р, ИЛ-2, ИЛ-2г, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12а, ИЛ-12Р, ИЛ-15, ИЛ-^SP, ИЛ-17а, ИЛ-18, ИЛ-23, ИЛ-28, ИЛ-29, IFNG, TNF, TGF в, FOXP3.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0».

Клиническую эффективность крема Тимоген® 0,05% оценивали на основании изменения иссле­довательской глобальной оценки (IGA — Investiga­tors’ Global Assessment) по 6-балльной шкале, где 0 баллов — чистая кожа (без признаков воспаления), 1 балл — почти чистая кожа (едва определяемая эритема, единичные папулы), 2 балла — легкий АтД (слабая эритема, папулы, инфильтрация), 3 балла — среднетяжелый АтД (умеренная эритема, умерен­но выраженные папулы), 4 балла — тяжелый АтД (выраженная эритема, инфильтрация, папулы), 5 баллов — очень тяжелый АтД (выраженная эри­тема, тяжелая инфильтрация, папулы с образова­нием корочек), субъективной оценки интенсивно­сти зуда и сухости кожи по 4-балльной шкале по отношению к исследуемому участку кожи.

Результаты и обсуждение

В основную группу были включены 20 человек, страдающих АтД, осложненным вторичной инфек­цией, у всех пациентов поражение кожи носило распространенный характер с локализацией на лице, шее, спине, груди и сгибательной поверхно­сти лучезапястных, локтевых и коленных суставов, отмечалось присоединение вторичной инфекции в виде мокнутия, фолликулита, присутствовал зуд от умеренного до сильного, усиливающийся в ночное время суток. Среднее значение индекса исследова­тельской глобальной оценки у больных АтД (n=20) при поступлении в период обострения составило 3,2±2,1, индекса зуда — 2,5±2,1, индекса сухости кожи — 3,1±1,7.

Эффективность крема Тимоген^® 0,05% у больных АтД

На фоне проводимой терапии кремом Тимоген® 0,05% у большинства больных АтД в течение 14 дней отмечалось значительное уменьшение ос­новных симптомов заболевания: зуда, сухости кожи, площади поражения кожи, количества вы­сыпаний, что отразилось в достоверном уменьше­нии средних значений индекса исследовательской глобальной оценки до 1,8±1,5, субъективных оце­нок зуда и сухости кожи — 1,6±1,2 и 2,2±1,4 (p<0,05 по критерию Уилкоксона) (рис. 1).

Рис. 1. Клиническая эффективность крема Тимоген^® 0,05%.

* — (p<0,05 по критерию Уилкоксона).

По оси абсцисс: критерии оценки клинической эффектив­ности крема Тимоген^® 0,05%, по оси ординат — шкала в бал­лах

Таким образом, использование крема Тимоген® 0,05% приводит к уменьшению основных симпто­мов АтД, а именно к уменьшению сухости, интен­сивности зуда, площади поражения кожи, что сви­детельствует о противовоспалительных, противо- зудных и увлажняющих свойствах препарата и о его эффективности при АтД.

Влияние крема Тимоген^® 0,05% на экспрессию генов цитокинов в коже и периферической крови больных АтД

При сравнении показателей экспрессии генов цитокинов в коже до лечения и после лечения кре­мом Тимоген® 0,05% в течение 14 дней отмечено до­стоверное увеличение уровня экспрессии гена ци­токина ИЛ-7 (р=0,047), уменьшение экспрессии генов ИЛ-8 (р=0,009) и ИЛ-5 (р=0,047) в коже боль­ных АтД по сравнению с теми же показателями до начала лечения. При сравнении данных показате­лей у больных АтД после лечения и у здоровых до­норов достоверных различий не выявлено (p>0,05 по критерию Манна-Уитни) (рис. 2).

Рис. 2. Сравнение экспрессии генов цитокинов в коже больных АтД и здоровых доноров до и после лечения кремом Тимоген^® 0,05%.

По оси абсцисс — значения экспрессии генов цитокинов в коже, по оси ординат — исследуемые цитокины

В периферической крови больных АтД до и пос­ле лечения кремом Тимоген® 0,05% различий в пока­зателях экспрессии генов цитокинов не отмечено.

Таким образом, в результате проведенного ис­следования показано, что при сравнении экспрес­сии генов цитокинов в коже больных АтД до и пос­ле лечения кремом Тимоген® 0,05% отмечается уменьшение экспрессии генов цитокинов ИЛ-5 и ИЛ-8, которые являются маркерами хронического воспаления, и увеличение экспрессии гена регуля­торного цитокина ИЛ-7,выявлена тенденция к нор­мализации данных показателей у больных АтД после лечения, приблизившихся к показателям здоро­вых доноров. Крем Тимоген® 0,05% обладает иммунотропной активностью, влияет на экспрессию ге­нов цитокинов в коже больных АтД и приводит к клиническому улучшению течения заболевания.

Литература: