Главная/Медиацентр/Материалы и Исследования/Протективная активность комбинации глутамил-триптофана и глицирризиновой кислоты при пероральном введении на модели экспериментальной летальной гриппозной инфекции у белых мышей, вызванной осельтамивирустойчивым штаммом вируса


МАТЕРИАЛЫ&ИССЛЕДОВАНИЯ

Протективная активность комбинации глутамил-триптофана и глицирризиновой кислоты при пероральном введении на модели экспериментальной летальной гриппозной инфекции у белых мышей, вызванной осельтамивирустойчивым штаммом вируса

СмирновВ.С.1, Гаршинина А.В.2, Штро А.А.2, Аникин В.Б.2, Галочкина А.В.2, Беляевская С.В.2, Зарубаев В.В.2

ЗАО Медико-биологический научно-производственный комплекс «Цитомед», 191023, г. Санкт-Петербург, Россия;

ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России, 197376, г. Санкт-Петербург, Россия

Журнал «Вопросы вирусологии», 2014. №5. – С.31-38

2014 Тимоген

Скачать PDF

Вирус гриппа является ведущей причиной инфекционной респираторной патологии человека. Поиск и разработка новых противогриппозных препаратов широкого спектра активности — важная задача медицинской науки. помимо собственно противовирусной активности соединений, большое значение имеет способ их использования. в настоящей работе изучена активность комбинации глутамил-триптофаном с глицирризиновой кислотой (препарат ГТГК) при пероральном применении в отношении осельтамивирустойчивого штамма вируса А/владивосток/2/09 (H1N1) на модели летальной гриппозной инфекции у белых мышей. Показано, что пероральное применение ГТГК приводит к снижению специфической смертности животных (индекс защиты 43-50%), увеличению средней продолжительности жизни животных на 2,5-3,9 сут и снижению титров вируса в ткани легких на 1,5-1,9 lg EiD50/20 мг в зависимости от дозы вируса. Соответствующие показатели для препа­рата сравнения тамифлю составили 14-25%, 1,1-1,9 сут и 0,7 lg EiD50/20 мг. Применение ГТГК также приводило к достоверному повышению титров интерферона в крови инфицированных животных с 44,3 до 66,3 ед/мл. Результаты морфологического анализа показали, что курсовое пероральное введение ГТГК сопровождается нормализацией структуры ткани легких, ограничением признаков воспаления и цитодеструкции. полученные данные позволяют рассматривать ГТГК как перспективное противогриппозное средство, активное в отноше­нии лекарственно-устойчивых штаммов вируса и пригодное для перорального применения.

Грипп представляет собой наиболее распространен­ную и опасную респираторную вирусную инфекцию. Он вызывает ежегодные эпидемии и пандемии, приво­дящие к значительному повышению уровня заболеваемости и смертности во всех регионах Земного шара [1]. Особую опасность этой инфекции придает способность возбудителя преодолевать межвидовой барьер между животными и человеком, что на протяжении последне­го десятилетия привело к вспышкам заболевания, вы­званного высокопатогенными вирусами H5N1, H7N7, H7N9, а также к пандемии 2009 г., вызванной вирусом H1N1pdm09.

Согласно современным представлениям, терапия гриппозной инфекции направлена, во-первых, на эли­минацию патогена из организма, во-вторых, на купиро­вание реактивных процессов. К первой группе относят­ся препараты, действующие непосредственно на вирус. Имеются две основные группы подобных содинений — блокаторы ионного канала и ингибиторы вирусной ней- раминидазы. Первая группа представлена препаратами ремантадин (а-метил-1-адамантил-метиламина гидрох­лорид) и амантадин (1-аминоадамантан) [2]. Ко второй группе относятся занамивир, осельтамивир (тамифлю), перамивир и ланинамивир [3]. Известен также препарат T-705 (фавипиравир), являющийся нуклеозидным ана­логом, блокирующим вирусную полимеразу и обладаю­щий широким спектром противовирусной активности [4], который проходит в настоящее время 3-ю фазу кли­нических испытаний в Японии.

Помимо побочных действий, присущих каждому пре­парату, следует отметить быстрое формирование к ним вирусной устойчивости [5]. Кроме того, важное место при разработке новых противовирусных соединений и лекарственных форм занимает проблема биодоступно­сти. Так, сравнивая два ингибитора нейраминидазы, за­регистрированных в России, следует сказать, что зана­мивир обладает преимуществом перед осельтамивиром в том смысле, что устойчивость к нему вирусов гриппа формируется реже и спектр ее не перекрывается с тако­вым для осельтамивира. Штаммы, устойчивые к осель- тамивиру, чувствительны к занамивиру. Тем не менее низкая биодоступность ограничивает его применение в клинике и делает эффективным лишь аэрозольный путь использования [5, 6].

Инфекционный процесс — это всегда процесс взаи­модействия паразита и хозяина, и по мере развития ви­русной инфекции все большую роль начинает играть реакция организма, развивающаяся в ответ на репли­кацию вируса и его влияние на систему врожденного иммунитета. Так, вирусы гриппа способны вызывать неадекватный воспалительный ответ со стороны хозяи­на, известный как «цитокиновый шторм», характерными признаками которого являются высокий уровень про­воспалительных цитокинов, массивная инфильтрация и отек легких [7]. Именно «цитокиновый шторм» и связан­ные с ним поражения респираторной системы были ве­дущими причинами летальных исходов при всех извест­ных пандемиях гриппа, начиная с «испанского» гриппа 1918 г. [8, 9]. Применение указанных выше противови­русных средств способно предотвратить фатальное раз­витие инфекции или по крайней мере снизить тяжесть течения заболевания, но только в том случае, когда та­кие средства больному назначают в раннем периоде за­болевания, как правило, не позднее 48-72 ч с момента появления первых клинических признаков заболевания [10, 11].

Для гашения «цитокинового шторма» и сопутствую — щих ему поражений в респираторном тракте уже на ран­них стадиях заболевания необходимо применять препа­раты иммуномодулирующей направленности, воздей­ствующие на факторы врожденного иммунитета хозяина и на процессы взаимодействия организма и вируса [12]. С этой целью используют широкий спектр препаратов разной химической природы, в частности ингибиторы циклооксигеназы (месалазин, целекоксиб), глюкокор­тикостероиды (дексаметазон, триамцинолон), агонисты PPAR-рецепторов (гемифиброзил, пиоглитазон), агони­сты толл-подобных рецепторов (эриторан, поли (И:Ц), глицирризиновая кислота) [12-14].

Последнее соединение представляет особый интерес в качестве средства, обладающего способностью влиять на широкий круг регуляторных реакций, которые обеспе­чивают направление и исход инфекционного процесса [13]. Показано, что глицирризиновая кислота блокирует такой медиатор воспаления, как высокомобильный груп­повой белок 1 [12], подавляет активацию фактора транс­ляции NF-kB [13], увеличивает ригидность клеточных мембран, затрудняя таким образом образование поры слияния [15]. В работе T. Utsunomya и соавт. [16] показа­но, что глицирризиновая кислота способна эффективно защищать мышей от острой летальной инфекции, вы­званной вирусом гриппа А (H2N2). M. Michaelis и соавт. [17] продемонстрировали, что глицирризиновая кислота ингибирует выработку провоспалительных цитокинов и хемокинов в макрофагах, инфицированных высокопа­тогенным вирусом гриппа H5N1. Ранее нами отмечена высокая протективная активность комбинации дипеп­тида глутамил-триптофана с глицирризиновой кислотой (ГТГК) при гриппозной инфекции у белых мышей при внутрибрюшинном способе применения [18]. Цель на­стоящего исследования — оценить влияние комбинации глицирризиновой кислоты с глутамил-триптофаном на течение острой экспериментальной инфекции, вызван­ной in vivo вирусом гриппа, устойчивым к осельтамиви- ру, при пероральном способе применения.

Материалы и методы

Препараты. В работе использовали комбинацию суб­станций глицирризиновой кислоты, тринатриевой соли и глутамил-триптофана натриевой соли. Аликвоты пре­паратов разводили в среде для клеточных культур Игла МЕМ («БиолоТ», Санкт-Петербург, кат. № 1.3.3). Из по­лученного раствора готовили необходимые разведения на среде МЕМ для экспериментов на животных. В каче­стве референс-препарата использовали тамифлю (осель- тамивира фосфат; LaRoche, Швейцария).

Вирусы. Использовали адаптированный к мышам ви­рус гриппа А/Владивосток/2/09 (H1N1). Устойчивость вируса к осельтамивиру ранее выявлена как неспособ­ность осельтамивира снижать активность нейрамини- дазы в хемилюминесцентном тесте и наличие амино­кислотной замены H274Y, обнаруженной при помощи секвенирования гена вирусной нейраминидазы. Вирус пассировали в аллантоисной полости 10-12-дневных куриных эмбрионов в течение 48 ч при 36°С в присут­ствии 10 мкг/мл осельтамивира.

Животные. Белых беспородных мышей (самки) мас­сой 12-16 г получали из питомника «Рапполово» (Ле­нинградская обл.) и содержали на стандартном рационе в условиях вивария ФГБУ «НИИ гриппа». Подбор жи­вотных в группы опыта проводили методом случайной выборки. До начала испытаний животные находились под наблюдением 1 нед.

Экспериментальная гриппозная инфекция. Для зара­жения животных использовали вируссодержащую ал­лантоисную жидкость куриных эмбрионов. Из нее гото­вили серию 10-кратных разведений на физиологическом растворе, после чего инфекционную активность вируса в заражающем материале определяли в отдельном экс­перименте при помощи титрования по летальности на животных. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча [19].

Исследуемые препараты вводили животным перораль­но через желудочный зонд в объеме 0,2 мл 1 раз в сутки в течение 5 дней начиная с 1-х суток после инфициро­вания животных. Разовые дозы составили: глутамил- триптофана 3 мг на 1 кг массы мыши; глицирризиновой кислоты 30 мг на 1 кг массы тела соответственно. Пре­парат сравнения применяли по той же схеме. В качестве плацебо животным контрольной группы вводили физио­логический фосфатный буфер. В качестве отрицатель­ного контроля использовали интактных животных, кото­рые содержались в тех же условиях, что и подопытные.

Вирус вводили животным интраназально под легким эфирным наркозом в количестве 1 LD (45 мышей на группу) и 10 LD50 (25 мышей на группу). На 3-и сутки после заражения 20 животных из группы, зараженной 1 LD50, и 10 животных из группы, зараженной 10 LD^, умерщвляли, вскрывали и у 10 животных из каждой группы изолировали легкие. У 10 животных из группы, зараженной дозой вируса 1 LD50, собирали кровь из сон­ной артерии и готовили сыворотку для последующего титрования интерферона. Из изолированных легких 5 использовали для выделения вируса (замораживали и хранили при -20°С до постановки соответствующих экс­периментов), оставшиеся 5 фиксировали 10% забуферен- ным формалином и использовали для гистологического анализа. Легкие животных, инфицированных вирусом в дозе 10 LD50, использовали только для выделения ви­руса. На 6-е сутки после заражения по 5 животных из групп, зараженных дозой вируса 1 LD50, вскрывали и ис­пользовали легкие для гистологического анализа.

Наблюдение за оставшимися животными осущест­вляли в течение 14 дней, т.е. срока, в течение которого при экспериментальном гриппе отмечается смертность животных. Ежедневно фиксировали смертность живот­ных в контрольных и опытных группах. На основании полученных показателей смертности в каждой группе рассчитывали процент смертности (M, отношение чис­ла павших за 14 дней животных к общему числу зара­женных животных в группе), индекс защиты (IP, отно­шение разницы процентов смертности в контрольной и опытной группах к проценту смертности в контрольной группе) и среднюю продолжительность жизни (СПЖ) животных из расчета 14 дней наблюдения в соответ­ствии со следующими формулами:

СПЖ = (Е N D)/Nt,

где N — количество животных, проживших D дней; Nt — общее число животных в группе;

M = M/Nt,

где M — число животных в группе, павших в течение 14 дней после заражения;

IP = ((Mc-Me)/Mc)-100%,

где Mc и Me — смертность в процентах в контрольной и опытной группах соответственно.

Титрование вируса в легочной ткани. Для определе­ния инфекционного титра вируса гриппа в легочной тка­ни животных легкие мышей, извлеченные на 3-и сутки после инфицирования, гомогенизировали в 10-кратном объеме стерильного физиологического фосфатного бу­фера и готовили из гомогенатов серию 10-кратных разве­дений на том же буфере. При определении титра вируса гриппа использовали культуру клеток MDCK (ATCC# CCL-34), выращенных на 96-луночных панелях на сре­де МЕМ. Клетки заражали серийными 10-кратными разведениями гомогенатов легких от 100 до 10-7 и ин­кубировали в термостате в течение 48 ч. По окончании срока инкубации культуральную жидкость переносили в лунки планшета для иммунологических реакций, после чего добавляли равный объем 1% куриных эритроцитов в физиологическом растворе.

Уровень репродукции вируса в лунках панели оцени­вали по реакции гемагглютинации (РГА) эритроцитов. За титр вируса принимали величину, противоположную десятичному логарифму наибольшего разведения виру­са, способного вызвать положительную РГА, и выража­ли в логарифмах 50% экспериментальной инфекцион­ной дозы (lg ЭИД50) вируса.

Гистологический анализ. Для морфологического ис­следования легкие фиксировали 10% формалином на фосфатном буфере, отмывали в проточной воде в те­чение ночи, дегидратировали в этаноле нарастающей концентрации, проводили через хлороформ, заливали в парафин и готовили из полученных блоков срезы толщи­ной 4 мкм. Срезы освобождали от парафина ксилолом, регидратировали в этаноле убывающей концентрации, окрашивали гематоксилином и эозином, дифференциро­вали в подкисленном спирте, окончательно обезвоживали в спиртах нарастающей концентрации, проводили че­рез две смены ксилола и заключали в бальзам. Получен­ные препараты исследовали под световым микроскопом Leica DM1000. Качественно оценивали интенсивность и клеточный состав воспалительного инфильтрата в оча­гах пневмонии, а также степень дегенеративных и про­лиферативных процессов в ткани легких.

Таблица 1. Изменения в динамике уровня смертности животных в ходе гриппозной пневмонии, вызванной вирусом гриппа А/Владивосток/2/09 (H1N1), в условиях применения химиопрепаратов

tabl121

Титрование активности интерферона. На 3-и сут­ки после заражения по 5 животных из каждой группы обескровливали. Образцы крови собирали в 1,5 мл по­липропиленовые пробирки, центрифугировали в тече­ние 20 мин при 5000 об/мин в настольной центрифуге и отбирали сыворотку. Cыворотку хранили при -20°С до постановки соответствующих экспериментов.

В качестве индикаторного вируса использовали вирус везикулярного стоматита, штамм Индиана (VSV). Для подготовки инфицирующего материала вирус размно­жали в культуре клеток L-41. Для этого 2-3-суточный монослой клеток заражали вирусом в количестве 10-100 ЦТД 50/мл. Клетки инкубировали до полной деструкции монослоя (24-48 ч) при 37°С в атмосфере 5% CO2, по­сле чего выдерживали 1 сут при 4°С. Культуральную жидкость отбирали, центрифугировали 15-20 мин в на­стольной центрифуге при 3000 об/мин и после опреде­ления инфекционной активности подвергали лиофиль- ному высушиванию.

Для определения инфекционной активности вируса готовили серию 10-кратных разведений вируссодержа­щего материала. Разведения VSV вносили по 0,2 мл на монослой клеток L-41 в микропланшетах. Планшеты выдерживали 24 ч при 37°С в атмосфере 5% СО2. Цито­патические изменения учитывали под микроскопом. По степени сохранности монослоя клеток определяли 50% цитотоксическую дозу вируса, т.е. дозу, вызывающую за этот период деструкцию 50% клеток в лунке.

Для изучения протективных свойств образцов сыво­ротки из них готовили серию двукратных разведений от 1:5 до 1:2560. Клетки линии L-929 (фибросаркома мы­ши, ATCC CRL-2148) выращивали в 96-луночных план­шетах (Costar, США) до состояния монослоя на среде MEM с добавлением 10% фетальной сыворотки («Био- лот», Санкт-Петербург).

Клетки L-929 инкубировали с разведениями ис­следуемой мышиной сыворотки в течение 24 ч в СО2— инкубаторе в атмосфере 5% СО2. По истечении этого срока клетки отмывали средой МЕМ и добавляли среду МЕМ, содержащую 100 ЦТД50/лунка VSV. Микроплан­шеты вновь помещали в термостат на 24 ч. После этого из микропланшетов удаляли среду и окрашивали клетки 0,1% водным раствором кристаллического фиолетового при комнатной температуре в течение 30 мин. Краси­тель экстрагировали из клеток 30% этанолом в течение 30 мин при 37°С, после чего оптическую плотность в лунках планшета измеряли на планшетном ридере для иммуноферментного анализа Victor 1420 (Perkin Elmer, Финляндия) при длине волны 590 нм. За титр интерфе­рона принимали величину, обратную наибольшему раз­ведению исходной сыворотки, при котором сохранялось 50% клеточного монослоя.

Статистическая обработка данных. Нормальность распределения величин проводили при помощи крите­рия Колмогорова-Смирнова в пакете программ Statistica 8.0. Статистическую обработку результатов (расчет средних значений и ошибки среднего) проводили при помощи программы Microsoft Excel. Достоверность раз­личий оценивали по критерию Стьюдента (Microsoft Excel) в случае нормально распределенных величин и критерия Манна-Уитни (Statistica 8.0) при распределе­нии, отличном от нормального. Достоверными считали различия между группами, если p не превышал 0,05.

Результаты

Протективная активность препаратов в опытах на животных. В ходе опыта по определению протектив- ной активности изученных препаратов на животных не отметили неспецифической смертности в контрольной группе интактных животных.

Клинические признаки заболевания были типичными для гриппозной инфекции. Они включали затрудненное дыхание, атаксию, тремор, а также снижение потребле­ния корма и воды.

Данные о динамике уровня смертности животных в контрольных и опытных группах суммированы в табл. 1.

Показано, что инфицирование приводило к дозозави­симой смертности животных в группах опыта начиная с 3-х суток после инфицирования. Применение препара­та сравнения тамифлю не сопровождалось снижением уровня смертности животных (индексы защиты 14-25% в зависимости от дозы вируса), что свидетельствует об устойчивости использованного штамма вируса к осель- тамивиру. Использование комбинации ГТГК приводило к повышению выживаемости животных по сравнению с таковой в контрольной группе. Индекс защиты при этом составил 43-50% в зависимости от дозы вируса. Одно­временно увеличивался показатель СПЖ на 2,5-3,9 сут в зависимости от дозы вируса. У животных, получавших тамифлю, достоверного увеличения СПЖ относительно плацебо практически не наблюдали.

Таблица 2. Инфекционная активность вируса гриппа в ткани легких белых мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Владивосток/2/09 (H1N1), в условиях применения исследованных препаратов

tabl122

Примечание. * — значения, отличия которых от контроля до­стоверны при p< 0,05.

Влияние препаратов на репродукцию вируса гриппа в организме животных. На следующем этапе исследования изучали влияние комплекса ГТГК на репликативную ак­тивность вируса гриппа в ткани легких инфицированных животных. С этой целью из легких животных на 3-и сутки после заражения приготовили гомогенаты, в которых затем определяли инфекционный титр вируса в культуре клеток.

Данные об уровне репликации модельного вируса гриппа в организме животных приведены в табл. 2.

Как видно из приведенных результатов, модельный вирус размножался в легочной ткани мышей до титров 4,6—5,1 log10EID50/20 мг ткани в зависимости от инфи­цирующей дозы. Применение тамифлю не приводило к существенному снижению уровня репродукции вируса, тогда как при использовании ГТГК отмечали достовер­ное снижение инфекционной активности вируса. Полу­ченные данные согласуются с профилем лекарственной устойчивости модельного вируса, использованного в эксперименте, а также с данными, полученными в экс­перименте по смертности животных.

Влияние препаратов на морфогенез эксперимен­тальной гриппозной инфекции у животных. На сле­дующем этапе исследований изучали особенности мор­фогенеза гриппозной инфекции в организме животных в условиях применения исследуемых препаратов.

Легкие интактных животных не имели макроскопиче­ских признаков воспаления. Крупные бронхи были вы­стланы однослойным эпителием, его клетки выглядели интактными — в них не отмечали признаков вакуолизации, конденсации или фрагментации ядер, а также внутрия­дерных или цитоплазматических включений. В просветах бронхов не выявили экссудата и клеточного детрита, ха­рактерных для деструктивных процессов в ткани. Респи­раторные отделы выглядели воздушными, альвеолярные стенки не утолщены, из клеток инфильтрата в легочной паренхиме отмечали отдельные альвеолярные макрофа­ги. Признаков серозного или геморрагического экссудата в альвеолярных полостях не обнаружили (рис. 1).

pic41

Рис. 1. Легкие интактной мыши. Поражения эпителия и воспалительные инфильтраты отсутствуют, межальвеолярные перегородки тонкие.

Здесь и на рис. 2, 3: окраска гематоксилином и эозином. Ув. 240.

У зараженных животных, не получавших лечения, морфологические изменения легочной ткани на 3-и сут­ки после инфицирования характеризовались поражени­ями в виде скоплений нейтрофилов и клеточного детри­та в просветах крупных бронхов, вирусспецифическим поражением клеток бронхиального эпителия с форми­рованием в них вирусных включений и отторжением пораженных клеток в просвет бронха. Базальная мембрана при этом обнажалась, что способствовало повышению ее проницаемости и миграции в просвет бронхов и аль­веол клеточных элементов. Эти процессы приводили к интенсивному серозному интерстициальному отеку, по­явлению очагов геморрагического отека, нейтрофильной инфильтрации и распада клеток в респираторных отде­лах, расширению сосудов и спадению альвеол (рис. 2, а). К 6-м суткам полиморфно-ядерный экссудат частич­но замещался круглоклеточным, тогда как в целом про­цессы воспалительной инфильтрации достигали своего пика (рис. 3, а). Просветы альвеол были целиком запол­нены клетками, межальвеолярные перегородки выгляде­ли утолщенными и отечными. Перечисленные явления типичны для интенсивно протекающей вирусной пнев­монии, и степень их выраженности, в частности степень дегенерации клеток бронхиального эпителия и воспали­тельной инфильтрации, может служить критерием для оценки тяжести процесса.

pic42

Рис. 2. Очаги гриппозной пневмонии в легком мышей на 3-и сутки после инфицирования вирусом гриппа А/Владивосток/2/09 (H1N1) в группе плацебо (а), при введении тамифлю (б) или ГТГК (в).

pic43

Рис. 3. Очаги гриппозной пневмонии в легком мышей на 6-е сутки после инфицирования вирусом гриппа А/Владивосток/2/09 (H1N1) в группе плацебо (а), при введении тамифлю (б) или ГТГК (в).

При использовании ГТГК отличия морфологической структуры легких животных, прошедших лечение, от таковых в контрольных группах были сходными. Основ­ное отличие от группы животных, не получавших лече­ния, заключалось в ограничении признаков вирусспе­цифического и реактивного поражения ткани легких на острой стадии гриппозной пневмонии. Как на 3-и, так и на 6-е сутки после инфицирования клетки бронхиаль­ного эпителия выглядели сохранными (рис. 2, в, 3, в) в отличие от разрушенных клеток с многочисленными ви­русными включениями у животных контрольной груп­пы (плацебо). Сами очаги воспаления занимали мень­шую площадь по сравнению с таковой в контроле. В то же время препарат сравнения тамифлю не приводил к существенному улучшению архитектоники легких (рис.

2, б, 3, б), что подтверждает данные об устойчивости ис­пользованного модельного штамма к осельтамивиру.

Влияние препаратов на содержание интерферона в сыворотке крови животных в ходе экспериментальной гриппозной инфекции. Для комплексной оценки протек- тивной активности ГТГК провели титрование активно­сти интерферона в сыворотке крови животных при по­мощи биологического метода. Результаты суммированы в табл. 3.

Как следует из представленных в табл. 3 данных, ин­тактные животные имели в крови очень малое количе­ство активного интерферона. Инфицирование осельта- мивирустойчивым вирусом гриппа приводило через 3 сут к 20-кратному возрастанию этого показателя. При использовании тамифлю индукция интерферона была выражена несколько слабее, чем у инфицированных животных, не получавших препаратов, однако разница в титрах интерферона не достигала достоверных зна­чений, что, возможно, обусловлено устойчивостью ис­пользованного штамма к тамифлю. У животных, полу­чавших ГТГК, титры интерферона были примерно на 50% выше, чем у животных, не получавших лечения. Полученные данные позволяют предполагать наличие у изучаемого препарата способности к активации врож­денного иммунитета, обусловливающей его протектив- ные свойства при гриппозной инфекции.

Таблица 3. Активность интерферона в сыворотке крови мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Владивосток/02/09 (H1N1), в условиях применения химиопрепаратов

tabl123

Примечание. р — коэффициент Стьюдента при сравнении с показателями в группе контроля вируса.

Обсуждение

В результате проведенного исследования продемон­стрирована активность комбинации ГТГК при перораль­ном применении на модели летальной гриппозной пнев­монии, вызванной осельтамивирустойчивым штаммом вируса гриппа. Показано, что такая комбинация обладает протективной активностью на использованной модели, снижая уровень смертности животных на 46% по срав­нению с таковой в группе плацебо. При этом повышение продолжительности жизни и снижение уровня специфи­ческой смертности сопровождались снижением инфекци­онной активности вируса гриппа в легочной ткани живот­ных, а также нормализацией морфологической структуры легочной ткани на 3-и и 6-е сутки развития гриппозной пневмонии. Это проявлялось ограничением протяженно­сти очагов пневмонии, снижением степени отека легких и воспалительной клеточной инфильтрации ткани. Кроме того, отмечена иммуномодулирующая активность ГТГК, проявляющаяся выраженной стимуляцией синтеза интер­ферона у инфицированных животных.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что при пероральном применении ГТГК сохраняет как про­тивовирусную, так и иммуномодулирующую активность, показанную ранее при внутрибрюшинном введении [16, 18]. Вопрос о конкретной лекарственной форме противо­вирусного препарата стоит особенно остро, когда речь идет о средстве, предназначенном для широкого исполь­зования в клинике. В ранее проведенных исследованиях установлено, что дипептид глутамил-триптофана, поми­мо иммуномодулирующих, проявляет ранозаживляющие свойства [20], что может быть свидетельством его воз­действия на базовые механизмы регуляции клеточного цикла. В работе W. Rose и соавт. [21] описана противо­вирусная активность глутамил-триптофана в отношении герпетической инфекции у животных, причем этот препа­рат проявлял активность при пероральном, но не при под­кожном использовании. Это может свидетельствовать о том, что метаболизм дипептида играет роль в проявлении его протективных свойств. В то же время в наших опы­тах активность ГТГК при пероральном применении ока­залась несколько ниже, чем при внутрибрюшинном [18]. Это можно объяснить различиями в патогенезе герпети­ческой и гриппозной инфекции, различными ключевыми точками, воздействие на которые имеет максимальные последствия для патологического процесса, а также при­сутствием в составе ГТГК второго компонента — глицир- ризиновой кислоты, активность которой может изменять акценты в механизме действия комплексного препарата по сравнению с монопрепаратами.

Показано также, что глутамил-триптофан усиливает противовирусное действие 2-бензил-бензимидазола ги­дрохлорида (бендазол) [22]. Комбинированный препарат цитовир-3, включающий глутамил-триптофан, бендазол и аскорбиновую кислоту, успешно применяется в качестве средства экстренной профилактики и раннего лечения острых респираторных вирусных инфекций и гриппа [23].

Таким образом, сочетание глутамил-триптофана с другими иммуномодулирующими соединениями, и в частности с глицирризиновой кислотой, открывает но­вые перспективы раннего и, возможно, отсроченного лечения острых респираторных вирусных инфекций и гриппа. Особый интерес представляет выявленная в данном исследовании эффективность комбинации глутамил-триптофана и глицирризиновой кислоты при пероральном применении на фоне гриппа, вызванного вирусом, который резистентен к ингибитору нейрами- нидазы — осельтамивиру.
Дополнительная информация: клинические исследования препаратов в Цитомед

Литература:

  1. Ahmed R., Oldstone M.B., Palese P. Protective immunity and sus­ceptibility to infectious diseases: lessons from the 1918 influenza pandemic. Immunol. 2007; 8: 1188-93.
  2. Scholtissek C., Quack G., Klenk H.D., Webster R.G. How to over­come resistance of influenza A viruses against adamantane deriva­tives Antiviral Res. 1998; 37: 83-95.
  3. Fiore A.E., Fry A., Shay D. et al. Antiviral agents for the treatment and chemoprophylaxis of influenza. MMWR Recomm. Rep. 2011; 60(1): 1-24.
  4. Furuta Y., Takahashi K., Shiraki K. et al. T-705 (favipiravir) and related compounds: Novel broad-spectrum inhibitors of RNA viral infections. Antiviral Res. 2009; 82: 95-102.
  5. Hauge S.H., Dudman S., Borgen K. et al. Oseltamivir-resistant influ­enza viruses A (H1N1), Norway, 2007-08. Infect. Dis. 2009: 15: 155-62.
  6. Samson M., Pizzorno A., Abed Y., Boivin G. Influenza virus resis­tance to neuraminidase inhibitors. Antiviral Res. 2013; 98: 174-85.
  7. Tisoncik J.R., Korth M.J., Simmons C.P. et al. Into the eye of the cytokine storm. Mol. Biol. Rev. 2012; 76: 16-32.
  8. Kumar A., Zarychanski R., Pinto R. et al. Critically ill patients with 2009 influenza A (H1N1) infection in Canada. 2009; 302: 1872.
  9. Perrone L.A., Plowden J.K., Garcia-Sastre A. et al. H5N1 and 1918 pandemic influenza virus infection results in early and excessive in­filtration of macrophages and neutrophils in the lungs of mice. PLoS Pathog. 2008; 4: e1000115. doi: 10.1371/journal.ppat.1000115.
  10. Aoki F.Y., Macleod M.D., Paggiaro P. et al. Early administration of oral oseltamivir increases the benefits of influenza treatment. Anti- microb. Chemother. 2003; 51(1): 123-9.
  11. Kandun I.N., Tresnaningsih E., Purba W.H. et al. Factors associated with case fatality of human H5N1 virus infections in Indonesia: a case series. 2008; 372(9640): 744-9.
  12. Darwish I., Mubareka S., Liles W. C. Immunomodulatory therapy for severe influenza. Expert Rev. Anti Infect. Ther. 2011; 9(7): 807-22.
  13. Schrofelbauer B., Raffetseder J., Hauner M. et al. Glycyrrhizin, the main active compound in liquorice, attenuates pro-inflammatory re­sponses by interfering with membrane-dependent receptor signaling. J. 2009; 421: 473-82.
  14. Tuvim M.J., Gilbert B.E., Dickey B.F., Evans S.E. Synergistic TLR2/6 and TLR9 activation protects mice against lethal influen­za pneumonia. PLoS One. 2012; 7(1): e30596. doi: 10.1371/journal. pone.0030596.
  15. Harada S. The broad anti-viral agent glycyrrhizin directly modulates the fluidity of plasma membrane and HIV-1 envelope. J. 2005; 392: 191-9.
  16. Utsunomiya T., Kobayashi M., Pollard R.B., Suzuki F. Glycyrrhizin, an active component of licorice roots, reduces morbidity and mortal­ity of mice infected with lethal doses of influenza virus. Agents Chemother. 1997; 41(3): 551-6.
  17. Michaelis M., Geiler J., Naczk P. et al. Glycyrrhizin inhibits highly pathogenic H5N1 influenza A virus-induced pro-inflammatory cy­tokine and chemokine expression in human macrophages. Mi­crobiol. Immunol. 2010; 199 (4): 291-7.
  18. Смирнов В.С., Зарубаев В.В., Анфимов П.М., Штро А.А. Влия­ние комбинации глутамил-триптофана с глицирризиновой кис­лотой на течение острой инфекции у мышей, вызванной виру­сом гриппа (H3N2). Вопросы вирусологии. 2012; 3: 23-7.
  19. Reed L.J., Muench H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. J. Hyg. 1938; 27: 493-7.
  20. Alterovitz G., Tuthill C., Rios I., Modelska K., Sonis S. Personal­ized medicine for mucositis: Bayesian networks identify unique gene clusters which predict the response to gamma-D-glutamyl-L-trypto- phan (SCV-07) for the attenuation of chemoradiation-induced oral mucositis. Oral Oncol. 2011; 47(10): 951-5.
  21. Rose W.A. 2nd, Tuthill C., Pyles R.B. An immunomodulating dipeptide, SCV-07, is a potential therapeutic for recurrent genital herpes simplex virus type 2 (HSV-2). J. Antimicrob. Agents. 2008; 32: 262-6.
  22. Смирнов В.С., Селиванов А.А. Биорегуляторы в профилактике и лечении гриппа. СПб.: Наука; 1996. 69 p.
  23. Смирнов В.С. Профилактика и лечение гриппа и острых респи­раторных вирусных инфекций. СПб.: АЙСИНГ; 2010.

Скачать PDF

Назад к списку